Électrophorèse, techniques de transfert et PCR
L´électrophorèse en gel est une technique très simple utilisée pour séparer des groupes d´ADN et de protéines. Souvent utilisée conjointement avec d´autres techniques, elle nécessite uniquement ce qu´indique son nom : un gel et de l´électricité.
À l´état naturel, l´ADN et les protéines portent une charge électrique. Ils se présentent également sous toutes formes et tailles. Dans l´électrophorèse en gel, on utilise ces deux propriétés pour séparer l´ADN et les protéines sur un coussin de gel avec un champ électrique.
Lorsque les brins d´ADN d´un échantillon humain sont incubés sur le coussin de gel avec un champ électrique, les brins commencent à se déplacer. La vitesse de leur mouvement dépend de leur taille. Un brin d´ADN de grande taille se déplacera plus lentement qu´un petit brin sur le gel. Après un certain temps, les brins d´ADN se retrouvent en différents groupes (appelés bandes), selon leur taille. À la fin du procédé, on obtient des groupes distincts d´ADN de même taille.
Cette technique est importante, car le regroupement et l´emplacement de ces bandes sur le gel est unique à chaque individu (de qui provient l´ADN) et permet de créer un profil de la personne. C´est pourquoi l´électrophorèse en gel fait partie des techniques de transfert (voir la page suivante) qui servent à analyser les empreintes génétiques.
Il existe trois différentes techniques de transfert : le transfert de Southern, le transfert de Northern et le transfert de Western. Le transfert de Southern détecte l´ADN, le transfert de Northern détecte l´ARNm (l´acide ribonucléique messager) et le transfert de Western détecte les protéines.
Les techniques de transfert sont souvent utilisées pour détecter des anomalies génétiques (détection de l´ADN) et certaines maladies infectieuses (détection de protéines).
Le transfert de Southern sert à détecter et à identifier certaines séquences d´ADN dans un échantillon de liquide organique. Il utilise des brins simples d´ADN pour découvrir leurs brins complémentaires.
Pour en apprendre davantage sur le pouvoir de fixation de l´ADN et des protéines.
Pour effectuer le transfert de Southern sur l´ADN, la première étape consiste à incuber l´ADN avec des enzymes de restriction.
Les enzymes de restriction coupent l´ADN à certaines séquences connues et produisent des fragments d´ADN d´une certaine longueur. Une fois l´ADN coupé en segments, les scientifiques utilisent l´électrophorèse pour regrouper ceux-ci selon la taille.
Ensuite, comme l´ADN dans le gel est en double hélice, on le sépare en brins simples. Les brins simples d´ADN sont ensuite transférés sur un morceau de papier spécial, car il est impossible de les atteindre dans le gel au moyen d´une sonde étiquetée (le gel est trop épais). Le transfert est précis et ne dérange ni l´emplacement, ni le regroupement des brins d´ADN. Cette technique s´appelle le « transfert ».
L´emplacement est important, parce que les scientifiques savent à quoi ressemble le profil d´une séquence d´ADN déterminée. Comme il y a habituellement plusieurs fragments par transfert, on utilise des sondes étiquetées pour identifier les différents fragments d´ADN. Si une des sondes étiquetées rencontre une paire complémentaire sur le papier de transfert, elle se fixe à elle. Plus tard, on utilise une méthode appelée autoradiographie pour lire l´emplacement de la connexion. Comme l´identité de la sonde étiquetée est déjà connue, on connaît aussi l´identité de l´ADN de l´échantillon.
Il n´y a qu´une seule différence entre le transfert de Southern et le transfert de Northern : le transfert de Northern utilise l´ARNm des échantillons au lieu de l´ADN. Donc, au lieu d´appliquer l´électrophorèse en gel à l´ADN, le transfert de Northern l´applique à l´ARNm. Comme l´ARNm se compose naturellement d´un seul brin, il n´est pas nécessaire de séparer les brins comme dans le cas du transfert de Southern.
Le transfert de Western sert à détecter différentes protéines. On applique l´électrophorèse en gel à certaines protéines particulières pour les regrouper selon leur taille. Comme dans le cas des autres techniques, on transfère les résultats sur un papier spécial. Le reste des étapes suit la méthode de la technique ELISA (voir ci-dessous).
Croyez-le ou non, cette technique n´existe pas. La première technique de transfert a été inventée dans les années 1970 par Edward Southern. Les noms northern et western ont suivi, en référence à la similitude des techniques.
ELISA est une technique qui permet de vérifier si une protéine particulière est présente dans un échantillon biologique. Elle permet de détecter soit des antigènes ou des anticorps en utilisant leur relation complémentaire.
Pour en apprendre davantage sur les antigènes et les anticorps.
Dans la technique ELISA, les chercheurs placent d´abord les antigènes qu´ils recherchent à l´intérieur d´un récipient en plastique. La plupart des antigènes se fixent à la surface du plastique. On peut éliminer tous les antigènes non fixés. Ensuite, on ajoute des anticorps provenant d´un échantillon humain. Si les anticorps de l´échantillon correspondent aux antigènes du récipient, ils s´y fixeront. Puisque ce lien n´est pas visible à l´oeil nu, on ajoute une deuxième solution d´anticorps, dans laquelle les anticorps sont fixés à une enzyme qui aide les chercheurs à détecter la présence de l´antigène. Si l´antigène est présent, le deuxième ensemble d´anticorps se fixe au premier. À l´étape finale, on ajoute une solution qui change de couleur en présence de l´enzyme. La couleur de la solution indique si le test est positif ou négatif, donc si l´antigène est présent dans l´échantillon de liquide organique du patient.
On peut se représenter ELISA comme l´enchaînement d´antigènes, d´anticorps et d´une enzyme : antigène + anticorps + anticorps et enzyme + solution = changement de couleur (positif ou négatif).
ELISA est à la base des tests de grossesse, ainsi que des tests de détection du VIH.
La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) est une méthode qui sert à copier des brins d´ADN ou d´ARN des milliers de fois en l´espace de quelques minutes, en utilisant la capacité naturelle d´une enzyme appelée polymérase à copier l´ADN. La PCR facilite le travail des scientifiques qui étudient un certain fragment d´ADN provenant par exemple d´un échantillon minuscule de liquide organique tel que le sang, en intensifiant sa présence.
Comme les séquences d´ADN sont propres à chaque espèce et à chaque individu de chaque espèce, la PCR peut servir à identifier une espèce ou un individu précis à partir d´un seul fragment d´ADN. C´est une technique si ingénieuse que, bien qu´on l´utilise principalement dans le domaine de la santé, elle sert couramment dans une variété d´autres disciplines telles que la justice et l´archéologie.
Avant d´amorcer le processus de PCR, les scientifiques doivent savoir deux choses : quelle partie de la séquence d´ADN ils veulent copier et quelles sont les séquences qui encadrent les deux extrémités de la portion désirée. La technique consiste à créer des copies complémentaires des séquences d´ADN situées aux extrémités en utilisant des enzymes spéciales, appelées « amorces », lesquelles définissent le début et la fin du processus de copie. Si on veut copier par exemple un brin d´ADN long de 20 nucléotides, non pas dans son entier, mais uniquement des numéros 3 à 7, on identifie les séquences des nucléotides précédant le 3 et suivant le 7 (les amorces), puis on forme deux segments complémentaires de ces séquences avant de démarrer la PCR.
Pour réaliser une PCR, il faut quatre choses : le fragment d´ADN ou d´ARN à copier, deux fragments amorces, la polymérase et un appareil spécial qui contrôle précisément la température.
D´abord, il faut séparer l´ADN choisi en deux brins simples d´ADN. Cette étape est nécessaire parce qu´un morceau d´ADN ne peut être copié lorsqu´il est sous forme de double hélice. Le procédé de séparation s´appelle « dénaturation ». La dénaturation se produit lorsqu´on chauffe l´ADN à une température de 90 à 96 degrés Celsius. L´étape suivante consiste à ajouter les amorces et à baisser la température pour faciliter la fixation. Comme les amorces sont complémentaires aux zones du début et de la fin de la séquence d´ADN choisie, elles se fixent sur ces zones et agissent comme indicateurs du début et de la fin du processus de copie. On ajoute ensuite la polymérase et on augmente légèrement la température pour atteindre la température idéale au bon fonctionnement de la polymérase. Celle-ci reconnaît les amorces et commence à copier. Le cycle entier se répète à plusieurs reprises jusqu´à ce qu´on obtienne des millions de brins d´ADN. Un cycle dure de une à trois minutes.
(En anglais seulement)
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