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Méthodes d’essais des inoculants à légumineuses
et
des semences préinoculées

Loi sur les engrais et article 23 du Règlement sur les engrais

DIVISION DE LA PRODUCTION DES VÉGÉTAUX
Agence canadienne d’inspection des aliments
Ottawa (Ontario) K1A 0Y9, Canada

Approuvé par le directeur de la Division de la production des végétaux

______________________
(Signature et date)

Dernière révision : Mai 2005

Méthode I: Essais de croissance de végétaux par la méthode du nombre le plus probable

Généralités

La présente méthode d’analyse repose sur les hypothèses suivantes :

1. Si une bactérie du genre Rhizobium viable est introduite chez son hôte spécifique dans un milieu exempt d’azote, des nodosités se formeront sur les racines de la légumineuse inoculée.
2. La formation de nodosités sur les racines de la plante inoculée est la preuve de la présence de rhizobiums infectants.
3. La propreté de l’épreuve est démontrée par l’absence de nodosités chez les plantes issues de semences non inoculées.
4. L’absence de nodosités est la preuve de l’absence de rhizobiums infectants.
5. La détermination du nombre le plus probable de rhizobiums sur des semences de légumineuses préinoculées est fondée sur la capacité de l’inoculant à induire la formation de nodosités chez un semis témoin aseptique de légumineuse.

Les inoculants et les semences préinoculées échantillonnés par les inspecteurs de l’Agence canadienne d’inspection des aliments sont protégés contre les conditions environnementales qui pourraient nuire à la viabilité des cultures bactériennes. Des sacs ou des contenants isothermes sont utilisés pour protéger les échantillons des écarts ou variations extrêmes de température pendant leur expédition. Ces échantillons sont accompagnés d’un échantillon témoin d’inoculant renfermant un nombre connu de cellules viables d’une espèce précise de Rhizobium. Les échantillons sont expédiés par le moyen de transport le plus rapide, en général par messagerie aérienne. À leur arrivée au laboratoire, ils sont immédiatement mis au réfrigérateur (4 °C à 10 °C).

Les échantillons de produit et l’échantillon témoin qui les accompagne sont testés par les analystes conformément aux protocoles mentionnés dans la présente méthode. Les résultats visant les échantillons de produit accompagnés d’un échantillon témoin jugé non satisfaisant ne comptent pas.

L’analyste délivre un certificat d’analyse indiquant les résultats pour chaque échantillon scellé qui lui aura été remis par un inspecteur. Ces certificats sont ensuite envoyés à l’inspecteur concerné aux fins de suivi, et une copie est transmise à la Section des engrais, à Ottawa.

Méthode NPP

Sachets de croissance jetable (pour toutes les semences à l’exception des pois chiches)

Le sachet (16 x 20 cm) est fait d’une pellicule de polyester fort et transparent pouvant résister à une stérilisation à la vapeur sous 100 kPa (15 lb//pouce²) pendant une période de 20 minutes. Dans ce sachet est inséré un manchon de papier-tissu pour germination qui est plié le long du bord supérieur pour former une augette et perforé pour permettre aux racines de s’échapper de l’aire des semis. Les sachets peuvent être divisés en fermant hermétiquement le sachet lui-même, et en divisant le papier de germination. Les sachets préparés sont ensuite stérilisés à la vapeur.

On ajoute 30 mL de solution nutritive stérile exempte d’azote dans chaque sachet stérilisé ((15 mL dans chaque compartiment pour les sachets à double compartiment), que l’on place dans un contenant individuel approprié qui servira de support durant le semis, l’inoculation et la croissance. Chaque unité de croissance est ensemencée dans des conditions aseptiques avec respectivement 20, 15 et 5 graines selon qu’il s’agit d’une légumineuse à graines petites, moyennes ou grosses. Les semences désinfectées en surface sont semées directement dans le sachet de croissance stérile et mises à germer à la noirceur, à 20 °C (pendant environ quatre jours) jusqu’à ce que les radicules mesurent entre 0,5 et 1,0 cm. Dans le cas des légumineuse à grosses graines (pois, soja), on peut faire prégermer les graines avant de les placer dans le sachet, et on procède comme suit : placer les graines sur trois couches de papier à germination Kimpak; placer les rouleaux dans une chambre humide, les radicules pointant vers le bas; faire germer à 20 °C (pendant environ quatre jours) jusqu’à ce que les radicules atteignent entre 0,5 et 1,0 cm. On peut aussi faire prégermer les graines dans de la vermiculite humide stérile. (NOTA : les graines prégermées peuvent être conservées jusqu’à deux semaines à 4 °C).

Gobelets de croissance (pour les pois chiches)

Des gobelets de prélèvement de spécimens de 250 mL en polypropylène transparent autoclavable (p. ex., Fisher Scientific) sont remplis de vermiculite très fine. La vermiculite est humidifiée avec de l’eau distillée, les gobelets sont couverts d’un carré d’aluminium très robuste, et le tout est autoclavé 121 °C, sous 100 kPa, pendant 20 minutes. Dans des conditions aseptiques, on transfère deux semences stérilisées dans le milieu de culture contenu dans les gobelets et on laisse germer à la noirceur à 20 °C. On peut faire prégermer les semences de pois chiche comme les semences à grosses graines ci-dessus.

Préparation des semences

Les semences non endommagées sont désinfectées en surface par immersion dans l’éthanol à 95 % pendant 30 secondes, suivi soit par (1) une immersion pendant 10 minutes dans une solution de peroxyde d’hydrogène (H₂0₂) à 3-5 %, soit par (2) une immersion pendant 10 minutes dans une solution d’hypochlorite de sodium (NaClO) à 5 %. Les semences sont ensuite lavées ou rincées à fond au moins cinq fois à l’eau distillée stérile.

Solution nutritive

Pour la culture des plantes, on utilise la solution suivante de sels minéraux stérilisée et exempte d’azote :

Préparation des dilutions pour les inoculants à base de tourbe

Toutes les dilutions, y compris la suspension initiale, sont effectuées dans une solution tampon stérile de phosphate-peptone de la composition suivante : peptone, 1.0 g; KH₂PO₄, 0.34 g; K₂HPO₄, 1.21 g; eau distillée, 1,000 mL; pH = 7.0 + 0.1.

On procède à une dilution au dixième (p/v) d’au moins 10 grammes d’inoculant dans un diluant tampon stérile de phosphate-peptone, et la solution est dispersée dans un mélangeur Waring pendant 2 minutes à 12 600 tpm, ou dans un sac à digestion Stomacher pendant une minute. On effectue ensuite une dilution au dixième (v/v) en transférant une aliquote de 1 mL de cette suspension tampon-inoculant dans un diluant tampon, et on agite le contenant pendant 5 minutes. Selon les besoins, on prépare ensuite des dilutions en série au dixième (v/v) en utilisant un minimum de 1 mL de suspension tampon-inoculant dans un diluant tampon. On procède ensuite à une série de dilutions au cinquième en mélangeant 1,0 mL de la dilution au dixième finale de la suspension bactérienne et 4,0 mL de tampon phosphate-peptone stérile. On procède ensuite à une série de six dilutions au cinquième consécutives, et toutes les dilutions, sauf la dernière, sont utilisées pour inoculer quatre unités de croissance (sachets ou gobelets) avec 1,0 mL de la suspension au niveau de dilution au cinquième approprié (voir la Figure 1, Dilutions pour la détermination du NPP). On utilise la dernière dilution pour inoculer cinq unités de croissance (sachets). L’inoculation est effectuée selon la méthode décrite ci-dessous dans la section « Inoculation ». Chaque série comporte un témoin non inoculé entre chaque série de quatre dilutions.

Figure 1. Dilutions pour la détermination du nombre le plus probable

Préparation des dilutions pour les inoculants liquides

On effectue une première dilution au dixième (1/10) en utilisant 10 mL d’inoculant et le tampon phosphate-peptone stérile, et on agite la suspension pendant 5 minutes. Selon les besoins, on prépare les dilutions subséquentes au dixième et au cinquième conformément à la section « Préparation des dilutions pour les inoculants à base de tourbe ».

Préparation des dilutions pour les inoculants à base d’argile

1. Peser 24 g d’inoculant à base d’argile dans un petit bécher.
2. Ajouter lentement 8 mL d’eau stérile à l’échantillon, goutte à goutte, et mélanger avec une spatule.
3. Laisser l’échantillon se réhydrater pendant 10 minutes.
4. Peser 20 g de cet échantillon.
5. Mesurer 130 mL d’eau stérile, verser dans un petit bocal d’un mélangeur Waring (Eberbach 8580), placer le bocal sur le mélangeur et régler l’appareil à basse vitesse.
6. Saupoudrer lentement l’échantillon de 20 g dans le bocal et mélanger pendant 90 secondes.
7. Retirer le volume voulu pour effectuer les dilutions en série et l’énumération.

La première dilution est au 10^-1 et exprimée sous forme de rhizobiums par gramme d’échantillon original déshydraté. Selon les besoins, on prépare des dilutions au dixième et au cinquième conformément à la section ci-dessus « Préparation des dilutions pour les inoculants à base de tourbe ».

Préparation des dilutions pour les inoculants en formulations granulaires à base d’argile et de tourbe

L’inoculant granulaire est réhydraté lentement en plaçant un minimum de 10 g d’inoculant dans une bouteille de dilution vide et en laissant reposer le contenant renfermant l’inoculant pendant une heure dans un milieu à atmosphère contrôlée (au moins 80 % d’humidité relative, à la température ambiante). On prépare une dilution au dixième en ajoutant du diluant tampon stérilisé dans la bouteille de dilution et on agite pendant une heure. On procède ensuite à des dilutions comme pour les inoculants à base de tourbe, conformément à la section « Préparation des dilutions pour les inoculants à base de tourbe ».

Préparation des dilutions pour les semences préinoculées (enrobées ou non enrobées)

1. Pour les légumineuses à graines moyennes ou à grosses graines, placer 200 semences préinoculées dans un contenant stérilisé.

2. Pour les légumineuses à petites graines, placer 10 g de semences préinoculées dans une bouteille de dilution vide. Pour les échantillons comportant un mélange de semences à petites graines, le pourcentage de légumineuses dans le mélange est utilisé pour calculer la taille d’échantillon requise pour obtenir 10 g de semences de légumineuses.

   EXEMPLE : Pour un mélange contenant 90 % de graines de luzerne et 10 % de fléole des prés, la taille de l’échantillon est calculée selon la formule suivante :

   On peut aussi extraire les semences préinoculées du mélange, d’après un examen morphologique des semences. Il faut alors compter 200 semences.

3. Pour les semences enrobées, le poids des graines utilisées est ajusté selon le pourcentage de matériel d’enrobage.

4. Tous les types d’échantillons de semences sont réhydratés lentement en laissant reposer le contenant ou la bouteille renfermant les semences pendant 1 heure dans un milieu à atmosphère contrôlée (au moins 80 % d’humidité relative, à la température ambiante).

5. Une fois le milieu équilibré, pour les légumineuses à grosses ou à moyennes graines, on ajoute 200 mL de tampon stérile peptone-phosphate à 0,1 % au contenant ou à la bouteille renfermant les 200 semences. La suspension initiale de 200 semences dans une solution tampon de 200 mL correspond à une semence par mL. On agite ensuite la solution semences-tampon pendant une heure.

6. Pour les légumineuses à petites graines, on ajoute 100 mL de tampon phosphate-peptone dans la bouteille de dilution. On agite ensuite la suspension initiale semences-tampon pendant une heure. Avant de procéder aux dilutions en séries, on ajuste la concentration de la suspension initiale semences-tampon de manière à obtenir une semence par mL. Pour calculer le volume de la suspension initiale semences-tampon nécessaire pour obtenir une suspension finale équivalente au nombre de rhizobiums obtenu à partir d’une semence par mL, on utilise la formule suivante :

   

où
V_i = fraction aliquote de la suspension initiale à étendre au volume final V_f(mL)
V_t = volume total (mL) de la suspension initiale
S = nombre de semences/kg (tableau A)
W_s = poids (g) de semences dans V_t

EXEMPLE : Si la suspension initiale est composée de 10 g de luzerne dans 100 mL de tampon et que la suspension finale doit être diluée jusqu’à un volume de 100 mL, le volume de l’aliquote nécessaire est calculé selon la formule suivante :

7. Pour le test NPP, on procède à des dilutions au cinquième de la suspension finale (concentration d’une semence par mL), après avoir calculé et effectué les ajustements requis pour les mélanges de semences et/ou les semences enrobées conformément à ce qui précède. Lorsqu’on utilise des semences à grosses graines préinoculées ou lorsque le nombre de rhizobiums dépasse le NPP, il peut être nécessaire d’effectuer des dilutions au dixième supplémentaires avant de procéder aux dilutions au cinquième. Pour effectuer ces dilutions, il faut un transfert initial d’un minimum de 1 mL.

8. À partir de la suspension, ou d’une dilution au dixième, on prépare des séries de dilutions au cinquième (1 mL dans 4 mL de diluant) pour 6 étapes de dilution. Au niveau de la dilution au cinquième, on inocule 1,0 mL de la suspension dans chacune des quatre unités de croissance (sachets ou gobelets) conformément à la méthode décrite ci-dessous. À chaque niveau de dilution, un sachet ou gobelet témoin non inoculé est inclus en plus des quatre sachets ou gobelets inoculés.

Inoculation

Pour l’inoculation, les dilutions appropriées (préparées pour chaque type de produit conformément à la méthode ci-dessus) sont placées dans les unités de croissance renfermant les semences germées. L’inoculant dilué est appliqué à la zone racinaire des semences germées, puis toute l’unité est transférée dans une chambre de croissance (phytotron).

Conditions de croissance

Généralités
Après l’inoculation, les sachets de croissance sont placés dans une chambre de croissance offrant un éclairement d’environ 16 000 lux. La température est maintenue à 22 °C pendant la période d’éclairement de 16 heures et à 18 °C pendant la période de noirceur. Le taux d’humidité est maintenu constant entre 65 et 70 %.

Pour les pois chiches uniquement
Après l’inoculation, on replace la feuille d’aluminium originale sur les gobelets. À mesure que les plantules apparaissent, les feuilles d’aluminium se trouvant sur les gobelets NPP sont remplacées par des gobelets en plastique transparent dont le fond a été enlevé et qui ont été stérilisés à l’éthanol. Les plantes sont arrosées au besoin.

Calcul du nombre le plus probable (NPP)

L’ensemble des végétaux qui se trouvent à l’intérieur d’un sachet ou d’un gobelet sont considérés comme une unité de croissance. Les unités de croissance sont conservées pendant trois semaines dans le phytotron avant qu’on y vérifie la présence de nodosités; les légumineuses à croissance lente (pois chiche, soja) sont examinées au bout de quatre semaines d’essai. S’il y a formation de nodosités dans l’unité de croissance, on inscrit un « + »; sinon, on inscrit un « - ». La présence d’une seule nodosité sur une seule plante est suffisante pour que l’unité de croissance soit considérée comme positive. On consigne le nombre d’unités de croissance positives (avec des nodosités) pour chaque niveau de dilution. À partir de la série de valeurs obtenues pour les 6 étapes de dilution, de la moins diluée à la plus diluée, on calcule le nombre le plus probable de rhizobiums présents dans l’échantillon et les limites supérieure et inférieure de confiance à 95 %, au moyen du logiciel du Système de calcul du nombre le plus probable (SCNPP) de Bennett, Woomer et Yost (NifTAL Project et Université d’Hawaii). La valeur finale du NPP correspond au nombre de rhizobiums par gramme ou par mL de produit, selon qu’il s’agit d’un inoculant solide ou liquide, ou au nombre de rhizobiums par semence, pour les semences préinoculées.

Si des dilutions au dixième supplémentaires sont nécessaires, le NPP est multiplié par le niveau de dilution au dixième requis pour obtenir le nombre de rhizobiums contenus dans l’échantillon. L’apparition de nodosités véritables sur les plantes témoins non inoculées annule les résultats du test.

Méthode II: Numération sur plaque

Milieu de culture pour la numération sur plaque

Pour les techniques de numération sur plaque, on utilise un substrat stérilisé à l’extrait de levure et à la gélose au mannitol, dont la composition est la suivante :

Le rouge Congo et le cycloheximide ne sont pas nécessaires pour la culture en boîte de Pétri d’inoculants préparés au moyen d’un support stérile.

Surveiller le pH des substrats autoclavés et ajuster au besoin au pH = 6,8 - 7,2.

Techniques de numération sur plaque

Les échantillons sont préparés et dilués conformément à la section précédente. Cent microlitres (100 µl) de dilution sont pipettés en triplicat à la surface du milieu de croissance, dans les boîtes de Pétri, et étalés au moyen d’une baguette de verre stérile recourbée en forme de « bâton de hockey ». Les boîtes sont incubées à l’envers à 30 °C. La période d’incubation est normalement de deux à trois jours pour les Rhizobium à croissance rapide et de cinq à six jours pour les Rhizobium à croissance lente. On fait ensuite la moyenne des boîtes de chaque niveau de dilution qui comptent entre 20 et 300 colonies.

Conformité des inoculants à légumineuses et des semences préinoculeés

Les normes visant les inoculants et les semences préinoculées sont prescrites par le Règlement sur les engrais. Selon ces normes, un inoculant doit contenir, par gramme de produit, suffisamment de cellules viables de l’espèce provoquant des nodosités pour produire, si le mode d’emploi est respecté, un nombre minimal de cellules viables par graine (N). Ce nombre standard varie selon la taille de la graine de l’espèce de légumineuse :

En plus de ces normes, le Règlement sur les engrais stipule que chaque emballage contenant un supplément doit porter une étiquette portant des renseignements, entre autres, qui garantissent que le produit contient le nombre minimal de cellules viables actives par gramme de produit (G) et ne porter aucune information inexacte ou trompeuse. Ces indications doivent toujours garantir la présence d’un nombre suffisant de cellules viables par gramme pour que, lorsque le produit est appliqué aux semences, il respecte le nombre standard spécifique de rhizobiums par graine. Cette donnée est vérifiée par la Section des engrais au moment de l’homologation du produit.

Notation des inoculants à légumineuses et des semences préinoculées

Les échantillons d’inoculants testés par la méthode du NPP sont cotés « satisfaisants » si la limite supérieure de confiance à 95 % pour le nombre de cellules de Rhizobium viables par gramme d’inoculant est égale ou supérieure à la valeur G (quantité minimale garantie sur l’étiquette). Pour que les échantillons de semences préinoculées soient satisfaisants, la limite supérieure de confiance à 95 % du nombre de rhizobiums viables par semence doit être égale ou supérieure au nombre N. L’échantillon de produit est insatisfaisant si la limite supérieure de confiance à 95 % pour le nombre de rhizobiums viables par gramme d’inoculant frais ou par semence est inférieure à la valeur G ou N, selon le cas, et que le témoin accompagnant l’échantillon est coté satisfaisant. Dans ce cas, on effectue immédiatement un autre test NPP sur le même échantillon. Pour qu’un échantillon soit coté « insatisfaisant », il doit se révéler insatisfaisant dans les deux tests NPP consécutifs. L’échantillon de produit n’est pas coté si l’échantillon témoin accompagnant le produit est coté « insatisfaisant » ou si l’échantillon n’est pas accompagné d’un échantillon témoin.

On calcule les limites de confiance à 95 % au moyen du programme informatique SCNPP, au moment de la détermination du NPP.

Échantillons témoins

Les échantillons témoins sont préparés dans un support stérile et analysés par numération sur plaque. Le nombre connu de rhizobiums viables par gramme d’inoculant frais témoin est établi (par numération sur plaque) avant la distribution des échantillons témoins aux inspecteurs de l’Agence canadienne d’inspection des aliments. Un échantillon témoin retourné est coté « satisfaisant » si la valeur de sa numération sur plaque est d’au moins 500,0 x 10⁶ rhizobiums/g.

NOTA : Les échantillons officiels NE SONT PAS valides si le témoin ne respecte pas la norme énoncée dans le présent document. Ces résultats ne seront pas utilisés comme une indication de la conformité de l’inoculant ou de la semence préinoculée, et aucune mesure réglementaire ne sera prise.

TABLEAU A. Principales légumineuses cultivées au Canada : nom scientifique en ordre alphabétique, nom français, nombre de semences par kilogramme et espèce de bactérie utilisée pour l’inoculation