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Document de décision DD98-27 :
Détermination du risque associé au cotonnier
(Gossypium hirsutum L.) BXN^md de Calgene

Le présent document de décisions vise à expliquer les décisions réglementaires prises conformément à la directive Dir95-03, Lignes directrices relatives à l'évaluation des végétaux à caractères nouveaux utilisés comme aliments du bétail, et à la directive Dir94-08, Critères d'évaluation du risque environnemental associé aux végétaux à caractères nouveaux.

L'Agence canadienne d'inspection des aliments (ACIA), plus précisément la Section des aliments du bétail, de la Division de la santé des animaux et d'élevage, avec la participation de l'Unité d'évaluation des risques phytosanitaires de l'ACIA et les conseils du Bureau de biotechnologie végétale de l'ACIA, a évalué les données présentées par la société Calgene Inc. à l'égard de certaines lignées de cotonnier (Gossypium hirsutum). Ces lignées, issues de la variété Coker 315, ont été modifiées par l'insertion de gènes leur conférant une résistance à l'herbicide bromoxynil ainsi qu'une résistance à la kanamycine, caractère servant à la sélection. L'ACIA a établi que les aliments du bétail dérivés de ces végétaux à caractères nouveaux ne devraient pas présenter de risques pour l'environnement ni pour le bétail qui les consommerait.

L'utilisation comme aliment du bétail des graines et du tourteau provenant des lignées 10215, 10222 et 10224 de cotonnier BXN^md est par conséquent autorisée. Il est également permis de disséminer toute autre lignée de Gossypium hirsutum qui en serait issue ou qui serait obtenue de la même façon, pourvu qu'aucun croisement interspécifique ne soit réalisé, que l'utilisation prévue soit semblable et qu'une caractérisation approfondie démontre que ces végétaux ne présentent aucun autre caractère nouveau.

Table des matières

1. Brève identification du végétal à caractère nouveau (VCN)
2. Données de base
3. Description des caractères nouveaux
   1. Tolérance au bromoxynil
   2. Résistance à la kanamycine
   3. Méthode de modification
   4. Stabilité de l'intégration au génome de la plante
4. Critères d'évaluation du risque environnemental
   1. Possibilité que le VCN se comporte comme une mauvaise herbe pour l'agriculture ou envahisse les milieux naturels
   2. Possibilités de flux génétique vers des espèces sauvages apparentées risquant de produire des hybrides se comportant davantage comme des mauvaises herbes ou possédant une plus grande capacité d'envahissement
   3. Possibilité que le VCN devienne nuisible
   4. Impact possible sur les organismes non visés
   5. Impact possible sur la biodiversité
5. Critères d'évaluation nutritionnelle en vue de l'utilisation comme aliment du bétail
   1. Facteurs antinutritionnels
   2. Composition nutritionnelle du VCN
6. Décision réglementaire

I. Brève identification du végétal à caractère nouveau (VCN)

II. Données de base

La société Calgene a créé trois lignées de cotonnier tolérantes au bromoxynil (herbicide). Les lignées 10215, 10222 et 10224, collectivement appelées « cotonnier BXN^md » dans le présent document, expriment une nouvelle tolérance permettant l'utilisation d'herbicide à base de bromoxynil pour contrôler ou éliminer des mauvaises herbes d'importance économique dans les champs de culture du cotonnier.

Les lignées BXN^md ont été mises au point par la technique de l'ADN recombinant, qui a permis d'insérer deux gènes bactériens dans la variété Coker 315. Un de ces gènes code une enzyme, une nitrilase, permettont la transformation du bromoxynil en composés non phytotoxiques. L'autre gène, qui confère une résistance à un antibiotique, la kanamycine, ne présente aucun intérêt agronomique ce dernier a seulement servi, pendant la mise au point des VCN, à distinguer les sujets transformés des non transformés.

Les lignées BXN^md ont fait l'objet d'essais au champ dans 57 localités réparties dans 13 états des États-Unis. Leur commercialisation a fait l'objet d'une approbation compléte dans ce pays. Par ailleurs, Santé Canada a établi que l'huile de coton provenant de ces lignées est essentiellement équivalente à celle produite à partir des cotonniers déjà commercialisés (août 1996).

Calgene a décrit en détail la méthode de transformation utilisée et a fourni des données sur l'identité des lignées BXN^md, sur les sites d'insertion, le nombre de copies et le degré d'expression des gènes dans la plante ainsi que sur le rôle des gènes insérés et des séquences régulatrices chez les organismes donneurs. Elle a présenté les séquences nucléotidiques complètes. La protéine nouvelle caractérisé comparé à la protéines bactérienne originale. De plus, Calgene a fourni des copies des publications scientifiques pertinentes.

Certaines caractéristiques agronomiques des VCN, comme le rendement, la vigueur des plants, la croissance, la morphologie, la germination et la floraison, ont été comparées à celles des contreparties de cotonnier non modifiées. Leur capacité d'adaptation au stress et notamment leur sensibilité à divers pathogènes ont été évaluées. Certaines caractéristiques technologiques de la fibre, comme l'indice micronaire, la longueur, la résistance et l'allongement, ont été comparées à celles des contreparties. Les VCN n'ont pas été jugés significativement différents.

Calgene a aussi fourni des données visant à montrer que la graine et le tourteau provenant du cotonnier BXN^md conviennent à l'alimentation du bétail.

La Section des aliments du bétail a passé en revue les renseignements qui précèdent, avec la participation de la division des risques phytosanitaires de l'ACIA et les conseils de la section de biotechnologie végétale. Pour évaluer le risque environnemental associé aux aliments du bétail dérivés de ces végétaux à caractères nouveaux et déterminer s'ils conviennent à l'alimentation du bétail, on a utilisé les critères suivants, décrits dans les directives de réglementation Dir94-08 et Dir95-03:

• impact possible sur le bétail lui-même;
• impact possible sur la nutrition du bétail;
• impact possible des VCN ou de leurs produits géniques sur des espèces non visées, y compris l'être humain;
• possibilité que les VCN deviennent nuisibles;
• possibilité que les VCN deviennent des mauvaises herbes pour l'agriculture ou envahissent les habitats naturels;
• impact possible sur la biodiversité;
• possibilité de flux génétique vers des espèces sauvages apparentées risquant de produire des hybrides se comportant davantage comme des mauvaises herbes ou possédant une plus grande capacité d'envahissement.

III. Description des caractères nouveaux

1. Tolérance au bromoxynil

• Le bromoxynil agit contre les dicotylédones en bloquant le flux des électrons durant la phase lumineuse de la photosynthèse.
• Un gène de Klebsiella pneumoniae, sous-espèce ozaenae codant une nitrilase (gène BXN) a été inséré dans la variété de cotonnier Coker 315 pour lui conférer au champ une tolérance contre les herbicides à base de bromoxynil.
• La nitrilase bactérienne catalyse la dégradation du bromoxynil en composés non phytotoxiques.
• Le gène de la nitrilase est lié à un promoteur constitutif qui contrôle son expression. Il est lié à une région 3' d'un gène d'Agrobacterium qui fournit une séquence de terminaison et un site de polyadénylation.
• La concentration de la nitrilase dans les graines non traitées (enveloppes, amandes et graines nettoyées à l'acide), dans les graines traitées et dans les feuilles a été mesurée par la technique de transfert Western (Western blot). L'expression de l'enzyme dans les végétaux transformés a été quantifiée par comparaison à des témoins, provenant de sujets non transformés de la variété Coker, dopés par ajout de nitrilase purifiée. Dans les graines, la concentration de nitrilase, était près du seuil de détection. Elle était moins élevée que dans les témoins dopés, qui contenaient 3,5 ng de nitrilase dans 600 g de protéines. La plus forte concentration de nitrilase calculée dans les protéines des graines non traitées était de 1,3 µg/g (1,3 ppm). Dans le tourteau, la concentration calculée dans les protéines totales a été de 0,6 µg/g (0,6 ppm) et dans les feuilles, la concentration maximale étatit de 20 µg/g.
• L'enzyme qui confère la tolérance au bromoxynil est une version bactérienne d'une enzyme qui est ubiquiste dans la nature, notamment chez les monocotylédones comme le maïs, le blé et l'orge, et qui, par conséquent, ne devrait pas être toxique ni allergène. La nitrilase n'a deplus aucune homologie appréciable avec les toxines et allergènes connus répertoriés dans la base de données FastDB. Elle s'est révélée peu stable en milieu gastrique simulé. Elle était complètement dégradée en peptides immunoactifs après 15 minutes dans 0,1 unité de pancréatine bovine. Après 8 heures, il n'y avait plus de signal décelable avec la technique de transfert Western blot.

2. Résistance à la kanamycine

• La kanamycine est un antibiotique de type aminoside qui se lie aux ribosomes bactériens, ce qui empêche la synthèse normale des protéines et cause la mort de la cellule bactérienne.
• Le gène de la résistance à la kanamycine, isolé à partir de la bactérie E. coli, code une enzyme qui provoque la phosphorylation de la kanamycine, ce qui l'empêche de se lier aux ribosomes et rend la cellule résistante.
• Le gène est lié à un promoteur constitutif. L'expression de l'enzyme aminoglycoside 3'- phosphotransférase II [APH(3') II] a été mesurée suivant la technique de transfert Western, par comparaison à un témoin dopé. Les concentrations maximales mesurées dans les graines, le tourteau et les feuilles sont, respectivement, de 6,6 µg/g, 5,7 µg/g et 80 µg/g dans les protéines totales.
• La protéine est ubiquiste dans l'environnement. Elle se dégrade rapidement in vitro, en présence de substances simulant les sucs gastriques et intestinaux des mammifères.
• La séquence nucléotidique ne présente aucune homologie appréciable avec celle des toxines et allergènes connus.

3. Méthode de développement

• Le cotonnier Coker 315 a été transformé à l'aide d'un vecteur non pathogène désarmé. Ce vecteur contenait la région de l'ADN-T d'un plasmide d'Agrobacterium tumefaciens dont les gènes responsables de la virulence et de maladies chez les plantes avaient été enlevés et où on avait inséré les gènes de la résistance au bromoxynil et à la kanamycine. On sait que l'ADN-T du plasmide s'insère au hasard dans le génome de la plante. Cette insertion est généralement stable, comme cela a été démontré chez le cotonnier BXN^md.

4. Stabilité de l'intégration dans le génome de la plante

• Des tests suivant la technique de transfert de Southern (Southern blot) ont été effectués pour confirmer la présence du gène BXN, puis celle du gène de la résistance à la kanamycine, chez les descendants des VCN originaux après cinq générations. Les patrons d'hybridation se sont révélées identiques aux patrons initiaux, indiquant qu'il n'y a pas eu de réarrangement et que l'insertion est stable. Les essais au champ ont montré que le gène est transmis suivant les lois mendéliennes.

IV. Critères d'évaluation du risque environnemental

1. Possibilité que le VCN se comporte comme une mauvaise herbe pour l'agriculture ou envahisse les milieux naturels

Le cotonnier (Gossypium hirsutum) appartient à la famille des Malvacées. Cette espèce est vivace mais se cultive comme une annuelle. Aux États-Unis, la zone de culture s'étend principalement, vers le sud et l'ouest, depuis la Virginie jusqu'à la Californie. Le cotonnier n'est pas considéré comme une mauvaise herbe dans les régions où on le cultive. Il n'est pas cultivé au Canada, car il n'est pas adapté aux conditions écologiques qui y existent.

Les lignées BXN^md ne présentent aucun nouveau gène leur conférant spécifiquement une tolérance au froid ou une capacité de survie hivernale; aucun plant ne peut survivre à l'hiver. D'ailleurs, ces lignées ne seront cultivées à aucun endroit au Canada.

D'après les caractéristiques biologiques de G. hirsutum, décrites dans la demande, les sujets non modifiés de cette espèce ne peuvent envahir les habitats sauvages au Canada. Selon les renseignements fournis par Calgene, les lignées BXN^md ne sont pas différentes de leurs contreparties non modifiées à cet égard.

2. Possibilités de flux génétique vers des espèces sauvages apparentées risquant de produire des hybrides se comportant davantage comme des mauvaises herbes ou possédant une plus grande capacité d'envahissementt

Le pollen du cotonnier est lourd et collant, et la fécondation croisée requiert normalement des insectes pollinisateurs, comme le bourdon et l'abeille domestique. Comme la plante est normalement autofécondée, l'étendue des croisements naturels entre cotonniers est très limitée.

Les cotonniers sauvages (G. barbadense et G. tomentosum) ne sont présents que dans les régions arides des zones tropicales et subtropicales. Il n'existe au Canada aucune espèce sauvage apparentée qui peut s'hybrider naturellement avec G. hirsutum. En conséquence, l'ACIA conclut qu'un flux génétique depuis les lignées BXN^md vers des espèces apparentées ne peut se produire au Canada.

3. Possibilité que le VCN devienne nuisible

Les effets recherchés au moyen des deux caractères nouveaux n'ont aucun lien avec le fait que les VCN puissent devenir des mauvaises herbes, sans compter que le cotonnier n'est pas une espèce nuisible au Canada. En outre, les caractéristiques agronomiques des lignées BXN^md se sont révélées semblables à celles des variétés de cotonnier actuellement commercialisées.

L'ACIA considère donc que les lignées BXN^md ne démontrent aucun potentiel de devenir nuisibles.

4. Impact possible sur les organismes non visés

La caractérisation précise des gènes nouveaux et des enzymes correspondantes, résumée dans la partie III du présent document, a permis de conclure que ces gènes et enzymes ne modifient pas la toxicité ou le pouvoir allergène de la plante. La nitrilase et l'APH(3')II sont rapidement inactivées par dégradation enzymatique en présence de substances simulant les sucs gastriques. Les graines non traitées des lignées BXN^md se sont révélées essentiellement équivalentes à celles des variétés traditionnelles sur le plan de la teneur en facteurs antinutritionnels. La teneur des graines en protéines et leurs compositions en acides aminés, en fibres, en huiles et en acides gras sont équivalentes à celles des contreparties non modifiées.

À la lumière de ces renseignements, l'ACIA estime que l'utilisation des lignées BXN^md pour l'alimentation du bétail n'aurait pas de répercussions négatives sur l'être humain et les autres espèces ayant des interactions avec G. hirsutum, par comparaison aux variétés de cotonnier actuellement commercialisées.

5. Impact possible sur la biodiversité

Les lignées BXN^md ne présentent aucune caractéristique phénotypique nouvelle qui puisse en étendre l'utilisation jusqu'au Canada depuis les zones actuelles de culture du cotonnier. Comme cette plante ne s'hybride au Canada avec aucune espèce sauvage apparentée, aucun caractère nouveau ne sera transféré dans les milieux sauvages. En conséquence, l'ACIA conclut que les lignées BXN^md n'auront aucun impact sur la biodiversité.

V. Critères d'évaluation nutritionnelle en vue de l'utilisation comme aliment du bétail

1. Facteurs antinutritionnels

La graine de coton renferme un grand nombre de facteurs antinutritionnels et, à l'état cru, ne convient pas à l'alimentation des animaux monogastriques. La transformation de la graine permet de diminuer sa teneur en toxines endogènes et de s'en servir pour fabriquer un tourteau convenant à l'alimentation du bétail. Le cotonnier contient naturellement du gossypol et des acides gras cyclopropénoïdes, considérés des composés antinutritionnels indésirables dans l'alimentation humaine et animale. Chez les lignées modifiées, les teneurs en gossypol et en acides gras cyclopropénoïdes sont comparables à celles des variétés parentales et se situent dans la gamme des valeurs observées chez les cotonniers cultivés. Les teneurs en gossypol de la lignée témoin Coker 315 et des lignées BXN^md sont de 1 % environ pour les graines entières. L'intervalle des valeurs naturelles est de 0,002 à 6,64 % pour les graines entières. Le pourcentage moyen d'acides gras cyclopropénoïdes dans l'huile des graines de coton des lignées BXN est de 0,71 %, soit le même que pour les témoins.

2. Composition nutritionnelle du VCN

L'analyse immédiate des graines des trois lignées BXN^md et de trois variétés commerciales cultivées à quatre endroits aux États-Unis a révélé des différences appréciables entre les quatre endroits pour les protéines et les lipides, mais aucun effet attribuable à la lignée ni aucune interaction emplacement–lignée, ce qui indique qu'il n'y a pas de différences entre les lignées BXN^md et les lignées témoins.

La composition en éléments nutritifs des graines des trois lignées BXN^md a été jugée essentiellement équivalente à celle des graines des variétés commerciales témoins.

VI. Décisions réglementaires

Après examen des données et des renseignements présentés par la société Calgene et après comparaison détaillée des lignées de cotonnier BXN^md avec des contreparties non modifiées, la Section des aliments du bétail de la Divsion de la santé dea animaux et de l'élevage conclut que les gènes nouveaux et les caractères correspondants ne soulèvent en soi aucune crainte quant à l'innocuité ou à la valeur nutritive des lignées BXN^md. La graine de coton et le tourteau de coton figurent actuellement à l'annexe IV du Règlement sur les aliments du bétail. Leur utilisation est donc approuvée pour l'alimentation du bétail au Canada. Comme elles ont été déclarées, après évaluation, essentiellement équivalentes aux variétés classiques de cotonnier sur le plan de l'innocuité et de la valeur nutritive, les lignées de cotonnier BXN^md et leurs produits sont considérés conformes à la définition actuelle d'ingrédient, et leur utilisation en cette qualité dans les aliments du bétail est approuvée au Canada. Par ailleurs, comme aucune des lignées BXN^md ne sera cultivée au Canada et que la graine du cotonnier ne peut survivre à l'hiver dans ce pays, leur dissémination sous forme d'aliments du bétail (tourteau ou graine) dans l'environnement n'aurait aucun effet, intentionnel ou non.

L'utilisation comme aliments du bétail des graines et du tourteau provenant des lignées 10215, 10222 et 10224 de cotonnier BXN^md est par conséquent autorisée. Il est également permis de disséminer toute autre lignée de Gossypium hirsutum qui en serait issue ou qui serait obtenue de la même façon, pourvu qu'aucun croisement interspécifique ne soit réalisé, que l'utilisation prévue soit semblable et qu'une caractérisation approfondie démontre que ces végétaux ne présentent aucun autre caractère nouveau.

Document publié par la Division de la production et de la protection des végétaux. Pour de plus amples renseignements, communiquer avec le Bureau de la biosécurité végétale ou avec la Section des aliments du bétail, aux adresses suivantes :