Étapes de confirmation pour les méthodes de détection de listeria spp. dans les aliments et les échantillons environnementaux

Annexe L

Direction générale des produits de santé et des aliments - Ottawa

Supplément à toutes les méthodes pour Listeria
Août 2005

Don Warburton, Franco Pagotto et Elaine Daley
Divisions de l'évaluation et de la recherche
Bureau des dangers microbiens, Direction des aliments
Repère postal : 2204A1
DGPSA, Ottawa (Ontario) K1A 0L2

Courriel : Don_Warburton@hc-sc.gc.ca
Franco_Pagotto@hc-sc.gc.ca

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1. APPLICATION

Les renseignements qui suivent sont présentés à titre de supplément à la méthode MFHPB-07, datée de mai 2003, à la méthode MFHPB-29, datée de janvier 2003, et à la méthode MFHPB-30, datée de janvier 2001, ainsi qu'à toutes les autres méthodes applicables à Listeria (sauf si stipulé spécifiquement dans la méthode) et doivent être utilisés avec ces méthodes. Ce supplément vise à fournir des renseignements supplémentaires (tels que des sources de matériel, des étapes critiques, des étapes de confirmation ou des conseils utiles, etc.).

6. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENT SPÉCIAL

Gélose au sang de cheval : recommandée pour l'hémolyse.
Gélose au sang de mouton : pour l'épreuve de CAMP.

AUTRES milieux et équipement (disponibles dans le commerce)

6.1 Gélose A.L. (BIO-RAD)

6.2 BBL CHROMagar Listeria (BD)

6.3 Plaque de gélose chromatogène pour Listeria (OCLA; Oxoid)

6.4 RAPID L. mono (BIO-RAD)

6.5 Système d'identification biochimique Oxoid (O.B.I.S) trousse mono (Oxoid)

6.6 Trousse d'agglutination au latex (trousse d'analyse Listeria d'Oxoid)

6.7 Trousses d'identification rapide, telles que les trousses Micro-ID (Remel ou Oxoid) ou l'équivalent

6.8 Tout équipement ou réactif requis pour la confirmation par PCR (voir la méthode MFLP-18 et autres méthodes du compendium)

6.9 Souches témoins recommandées :

7.5 Méthode d'isolement

7.5.1 Après avoir mélangé au vortex, ensemencer le bouillon d'enrichissement secondaire en stries sur deux milieux différents. Utiliser une gélose d'Oxford (OXA) et l'une des géloses suivantes : gélose au chlorure de lithium, au phényléthanol et au moxalactame (LPM), gélose d'Oxford modifiée (MOX), gélose de PALCAM (PAL), ou l'une des géloses chromatogènes suivantes : gélose A.L., gélose ALOA, BBL CHROMagar, OCLA, gélose RAPID L. Mono (consulter les sections 7.5.5 et 7.5.6). Incuber les géloses LPM à 30 °C pendant 24 à 48 heures et les géloses OXA, MOX et PAL à 35 °C pendant 24 à 48 heures. Suivre les instructions du fabricant pour les autres géloses.

7.5.2 Géloses LPM - Pour repérer les colonies suspectes sur les géloses LPM, examiner les boîtes au moyen d'un faisceau de lumière blanche orienté de manière à éclairer le fond de la boîte à un angle de 45° et assez puissant pour bien éclairer la boîte. Si la transillumination est optimale, les colonies de Listeria les plus isolées et les plus grosses (âgées de 48 heures) ont l'aspect de petites piles blanchâtres de verre concassé et présentent souvent des structures internes en mosaïque et parfois des reflets iridescents bleu-gris qui ont tendance à scintiller. Les colonies peuvent aussi être lisses et ourlées de bleu. Lorsque la croissance est presque confluente, on peut observer un reflet bleu-gris iridescent et homogène.

7.5.3 Géloses OXA et MOX - Après 24 heures, L. monocytogenes forme des colonies noires de 1 mm de diamètre entourées d'un halo noir. Après 48 heures, on observe des colonies noires de 2 à 3 mm de diamètre entourées d'un halo noir et dont le centre est affaissé. Les colonies peuvent aussi présenter une couleur brun-noir ou vert-noir. D'autres espèces de Listeria ont un aspect semblable. Si les boîtes sont examinées moins de 24 heures après le début de l'incubation, on peut parfois déceler des colonies de Listeria mais sans la coloration noire caractéristique. Certaines souches de Listeria autres que L. monocytogenes sont inhibées par ce milieu lorsqu'il est incubé à 35 °C.

7.5.4 Géloses PAL - Les colonies de L. monocytogenes ont une coloration gris-vert et mesurent environ 2 mm de diamètre. Leur centre est noir et affaissé et elles sont entourées d'un halo noir sur fond rouge cerise. Certaines souches d'Enterococcus et de Staphylococcus forment des colonies grises entourées d'un halo brun-vert ou des colonies jaunes entourées d'un halo jaune.

7.5.5 Milieux chromatogènes - Les géloses suivantes ont été évaluées et peuvent être utilisées. Suivre les instructions du fabricant pour les préparer et les utiliser.

Gélose A.L. : Toutes les espèces de Listeria forment des colonies bleues à bleu-vert, les colonies de L. monocytogenes et de L. ivanovii formant des halos opaques autour des colonies après 24 et 48 heures respectivement.

Gélose ALOA : Les colonies L. monocytogenes ont une coloration bleu-vert avec un halo, alors que les autres espèces de Listeria sont bleu-vert sans halo.

BBL CHROMagar : L. monocytogenes et L. ivanovii forment des colonies bleu-vert entourées d'un halo blanc opaque. Les autres espèces Listeria forment des colonies bleu-vert sans halo.

Gélose OCLA : Toutes les espèces de Listeria forment des colonies bleues et L. monocytogenes produit un halo blanc opaque après 24 h.

RAPID L. Mono : L. monocytogenes forme des colonies bleues sans halo jaune alors que L. ivanovii forme des colonies bleu-verdâtre avec un halo jaune; les autres espèces de Listeria sont d'une couleur jaune à blanche.

7.5.6 Autre gélose chromatogène ou nouvelle - De nouvelles géloses chromatogènes et d'autres géloses d'isolement peuvent être utilisées, mais seulement de concert avec les milieux ci-dessus.

7.6 Méthode d'identification - Confirmation

7.6.1 Sélection des colonies :

Si les colonies sont bien isolées sur les géloses sélectives: Prélever au moins cinq colonies caractéristiques de chaque gélose sélective et les déposer sur de la gélose au sang de cheval (comme en 7.6.2). Si confirmé par Multiplex PCR, procéder alors à 7.6.5. Si les colonies ne sont PAS bien isolées sur les géloses sélectives: prélever au moins cinq colonies caractéristiques de chaque gélose sélective et les déposer sur de la gélose au tryptose (TA) ou de la gélose trypticase-soja avec de l'extrait de levure à 0,6 % (TSA-YE) en formant des stries pour la séparation. Incuber les géloses à 30 °C pendant 24 à 48 heures ou jusqu'à ce que la croissance soit satisfaisante. Au besoin, examiner les boîtes sous l'éclairage déjà décrit en 7.5.2 pour déceler les colonies caractéristiques.

7.6.2 Hémolyse :

Quadriller le fond des boîtes de gélose au sang de cheval de façon à obtenir de 20 à 25 carrés. Prélever des colonies caractéristiques des géloses sélectives (si les colonies sont bien isolées) ou des géloses TA ou TSA-YE (si elles sont ensemencées pour la pureté) et ensemencer les géloses au sang de cheval par piqûre à raison d'une colonie par carré.
Il faut toujours ensemencer par piqûre des témoins positifs et négatifs (L. monocytogenes, L. ivanovii et L. innocua). Incuber pendant 24 heures à 35 °C.

Examiner par transillumination, au moyen d'un éclairage intense, les géloses au sang ensemencées par piqûre (tenir la gélose de façon à ce que la lumière provienne de l'arrière). L. monocytogenes produit une zone d'hémolyse légère au point de piqûre; L. innocua ne produit aucune zone d'hémolyse tandis que L. ivanovii produit une zone franche d'hémolyse au point de piqûre.

7.6.3 Motilité :

Gélose : Ensemencer le milieu d'analyse de la motilité à partir des géloses sélectives, TA ou TSA-YE. Incuber pendant 48 heures (jusqu'à 7 jours) à la température ambiante. Observer tous les jours. Consigner la motilité et disposer lorsqu'une motilité atypique ou typique est évidente. Il n'est pas obligatoire d'incuber pour toute la durée de 7 jours. Cette décision est à la discrétion du superviseur de laboratoire. SEULES les cellules de Listeria produisent une croissance typique en forme de parapluie.

et / ou :

Montage humide : Prélever au moins une colonie caractéristique de chaque gélose sélective, TA ou TSA-YE et procéder à un examen par montage humide en utilisant une solution physiologique à 0,85 % comme milieu de suspension et l'objectif à immersion d'huile d'un microscope à contraste de phase. Ou alternativement : Inoculer des bouillons de TSB-YE ou TB et incuber jusqu'au lendemain à 30 °C. Transférer une anse des cultures dans un bouillon TSB-YE ou TB frais et incuber à 25 °C pendant 6 heures. Déposer une goutte de chaque culture de 6 heures sur une lame de verre et examiner pour la motilité typique de Listeria au moyen d'un microscope à contraste de phase muni d'un objectif à immersion. Les Listeria sont des bâtonnets fins, courts, qui bougent par culbute. Il faut toujours les comparer à une culture de Listeria connue. Les coques, les gros bâtonnets et les bâtonnets qui se déplacent rapidement par des mouvements natatoires ne sont pas des Listeria.

7.6.4 Utilisation des glucides

Géloses Quadriller le fond des boîtes de gélose aux glucides (mannitol, rhamnose et xylose) de façon à obtenir de 20 à 25 carrés. Prélever des colonies caractéristiques des géloses sélectives ou des géloses TA ou TSA-YE et ensemencer les géloses par piqûre à raison d'une colonie par carré. Il faut s'assurer que chaque colonie est placée au même endroit dans tous les carrés. Il faut toujours préparer des témoins positifs et négatifs (L. ivanovii, L. monocytogenes et L. grayi ou L. innocua). Voir le Tableau 1 comme guide. Incuber pendant 24 heures à 35 °C. Des bouillons aux glucides contenant 0,5% de glucide dans une base de bouillon pourpre peuvent aussi être utilisés.

et / ou :

Bouillons Utiliser la culture sur TSB-YE pour ensemencer des bouillons pourpres additionnés de solutions de dextrose, d'esculine, de maltose, de mannitol, de rhamnose, d'α-méthyl-D-mannoside et de xylose à 0,5 %. Incuber à 35 °C pendant 7 jours. Examiner les milieux tous les jours. Les Listeria spp. acidifient le milieu sans dégager de gaz ou ne produisent aucune réaction. Consulter le tableau 1 pour les caractéristiques de fermentation des glucides des diverses espèces de Listeria. Toutes les espèces de Listeria devraient fermenter le dextrose, l'esculine et le maltose. Toutes les espèces de Listeria, à l'exception de L. grayi et L. murrayi, devraient être mannitol-négatives.

7.6.5 PCR multiplex

Suivre la méthode MFLP-18 ou autres méthodes du compendium qui utilisent la PCR pour la détection de L. monocytogenes ou des espèces de Listeria. Il est suggéré que les colonies qui ont été identifiées par PCR soient ensemencées sur une gélose SA ou TSA-YE à partir de la gélose au sang (7.6.1) pour obtenir des isolats de positifs. Des épreuves biochimiques peuvent être nécessaires si elles sont mentionnées dans la méthode PCR; VOUS DEVEZ VÉRIFIER LA MÉTHODE PCR SPÉCIFIQUE POUR DES DIRECTIVES. Voir aussi la méthode PCR pour une interprétation des résultats de la PCR.

7.7 Méthode d'identification - Épreuves facultatives

7.7.1 Trousses d'identification rapide

Des trousses d'identification rapide comme le Vite, API Listeria , Micro-ID Listeria et le test Listeria Accuprobe^MD peuvent être utilisées. Suivre les instructions du fabricant pour les utiliser.

7.7.2 Catalase

Soumettre une colonie caractéristique à une épreuve de la catalase. Transférer une colonie sur une lame de verre propre et ajouter une goutte de peroxyde d'hydrogène à 3 %. La formation de bulles indique une réaction positive. Les cellules de Listeria sont catalase-positives. Éviter de prélever des colonies à partir de gélose contenant du sang car elles peuvent produire un résultat faussement positif.

7.7.3 Coloration de Gram Listeria est un petit bâtonnet Gram-positif.

7.7.4 Épreuve de CAMP Sur une gélose au sang de mouton, étaler en stries verticales des isolats frais de souches de Staphylococcus aureus et de Rhodococcus equi ß-hémolytiques. Espacer les stries verticales de manière à pouvoir étaler les souches à l'étude en stries horizontales sans toucher aux stries verticales. Après 24 à 48 heures d'incubation à 35 °C, rechercher les zones d'hémolyse à proximité des stries verticales.

7.7.4.1 L'hémolyse de L. monocytogenes et de L. seeligeri est plus prononcée à proximité de la strie de Staphylococcus et celle de L. ivanovii est plus prononcée à proximité de la strie de Rhodococcus. Les autres espèces de Listeria sont CAMP-négatives. L'épreuve permet de distinguer L. ivanovii de L. seeligeri et permet également de distinguer une souche de L. seeligeri faiblement hémolytique de L. welshimeri.

7.7.4.2 On peut également réaliser l'épreuve de CAMP au moyen de disques stériles de ß-lysine disponibles dans le commerce et qui renferment le facteur S. aureus. Dans cette épreuve, un disque de ß-lysine est déposé au centre de la gélose au sang de mouton et 4 ou 5 cultures de Listeria sont ensemencées en stries radiales à partir du disque, sans toucher le disque avec l'inoculum. Après 18 à 24 heures d'incubation à 35 °C, on peut observer une réaction CAMP très nette entre le disque et les cultures de L. monocytogenes ou L. seeligeri. L. ivanovii est fortement hémolytique et produit une zone claire de ß-hémolyse tout le long de la strie.

7.7.5 Sérologie

Suivre les instructions du fabricant jointes aux antisérums.

7.7.6 Agglutination au latex

Suivre les instructions du fabricant. Certaines trousses confirmeront la présence de Listeria spp. seulement.

7.7.7 Trousse OBIS mono

Suivre les instructions du fabricant. Cette trousse différenciera Listeria spp. et L. monocytogenes. Vous devez utiliser des cultures témoins fraîches (pour la nuit, 18 à 24 heures) de L. monocytogenes et un autre Listeria spp. pour s'assurer de la bonne interprétation de la réaction de coloration; L. monocytogenes ne donne aucune couleur et va jusqu'à une nuance rose alors que toutes les autres espèces de Listeria donnent une couleur pourpre foncée.

7.8 Interprétation des résultats pour l'identification de l'espèce

Les espèces de Listeria se présentent sous la forme de petits bâtonnets mobiles Gram-positifs. Elles sont catalase-positives, uréase-négatives et acidifient la pente et le culot du milieu TSI sans production de H2S. Les Listeria fermentent le dextrose, l'esculine et le maltose; certaines espèces fermentent également le mannitol, le rhamnose et le xylose et acidifient les milieux. Toutes les espèces donnent une réaction +/+ dans le bouillon RM-VP. L. grayi et L. murrayi sont les deux seules espèces à fermenter le mannitol, et L. murrayi, la seule espèce à réduire les NO₃- en NO₂-.

L. monocytogenes, L. ivanovii et L. seeligeri hémolysent (faiblement) les géloses au sang de cheval ou au sang de mouton. Les trois espèces donnent une réaction positive à l'épreuve de CAMP. L. monocytogenes est la seule des trois espèces qui ne fermente pas le xylose, mais fermente le rhamnose. L'épreuve de CAMP permet de distinguer L. ivanovii de L. seeligeri, puisque L. seeligeri produit une zone d'hémolyse prononcée uniquement à proximité de la strie de Staphylococcus, et que L. ivanovii produit une zone d'hémolyse prononcée à proximité de la strie de R. equi.

L. innocua se différencie de L. monocytogenes uniquement par son incapacité à hémolyser la gélose au sang et par une épreuve de CAMP négative. Si l'on ne procède pas à l'épreuve de CAMP, on risque de confondre L. welshimeri, qui est rhamnose-négatif, et L. seeligeri, qui est faiblement hémolytique.

Les tableaux ci-joints fournissent un sommaire des caractéristiques biochimiques et sérologiques, ainsi que de la pathogénicité des différentes espèces de Listeria. Il faut recueillir toutes les données avant de déterminer les espèces microbiennes.

8. BIBLIOGRAPHIE

8.1 Atlas, R.M. 1997. Handbook of Microbiological Media. Deuxième édition. L.C. Parks (éditeur). CRC Press Inc.

8.2 Seeliger, H.P.R. et D. Jones.1986. The Genus Listeria. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume 2. Williams and Wilkins, Baltimore. pp. 1235-1245.

Tableau 1

Caractéristiques distinctives des espèces du genre Listeria^a

a. Adapté d'après la référence 8.2.
b. Symboles standard: (+) positif; (-) négatif; + : 90 % et plus de positifs; - : 90 % et plus de négatifs; d : entre 11 et 89 % des souches sont positives.
c. Toutes les souches de L. monocytogenes ne sont pas nécessairement bêta-hémolytiques - la souche ATCC 15313 n'hémolyse pas le sang de cheval, de mouton ou de bœuf.
d. Les souches de L. ivanovii présentent habituellement une zone d'hémolyse très large ou des zones multiples d'hémolyse.
e. Des 30 souches étudiées, seule la souche type ATCC 15313 n'a pas donné de réaction positive.
f. Des 10 souches étudiées, une seule a donné une réaction positive.

Tableau 2

Sérologie, activité hémolytique et virulence pour la souris de différentes espèces de Listeria

* in = indéterminé.

Tableau 3

Réactions des espèces de Listeria à l'épreuve de CAMP

Tableau 4

Échantillonnage des aliments prêts à manger¹ (PAM) dont l'analyse vise à
déterminer la présence de L. monocytogenes (Lm)

1. Pour une définition des aliments PAM, voir la dernière version du guide d'application de la réglementation intitulé « Politique sur la présence de Listeria monocytogenes dans les aliments prêts à manger ».
2. En établissant la liste des aliments de la catégorie 1, on s'est penché sur les aliments PAM pour lesquels il y avait déjà un lien de cause à effet avec des éclosions de listériose et/ou ceux considérés comme étant à «risque élevé» dans la récente évaluation de la HHS/USDA intitulée «Évaluation quantitative des risques pour la santé publique provenant de Listeria monocytogenes alimentaire pour des catégories choisies d'aliments prêts à manger (2003)».
3. Pour le moment, ce produit n'est pas courant sur le marché canadien.
4. Des synonymes pour la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) comprennent l'omble de mer, la truite de mer profonde, la truite steelhead et le saumon arc-en-ciel.
5. Les aliments PAM réfrigérés qui ne supportent pas la croissance de Lm comprennent les suivants :

1. pH 5,0 à 5,5 et aw < 0,95;
2. pH < 5,0, sans égard à l'aw;
3. aw ≤ 0,92, sans égard au pH;
4. aliments congelés.
   Le pH et l'aw doivent être mesurés sur au moins 3 des 5 unités d'analyse. On considère que l'aliment supporte la croissance de L. monocytogenes si au moins une des unités d'analyse a une valeur de pH et d'aw dans l'échelle des valeurs qui permettent à l'organisme de se multiplier.

6. L'unité d'analyse désignée doit être prélevée à partir de chaque unité d'échantillonnage.
7. Pour les aliments de la catégorie 3, si les bonnes pratiques de fabrication (BPF) sont inadéquates et si l'on a détecté L. monocytogenes dans les aires de manutention du produit fini, ou lorsqu'il est impossible de déterminer le statut des BPF, les aliments peuvent être analysés selon les méthodes MFLP-74 (Dénombrement de Listeria monocytogenes dans les aliments) et MFHPB-30 ou leur équivalent, selon le cas (Pagotto et al, 2001; 2002).