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5.1. Matériel et équipement5.1.1 Matériel et équipements spéciaux fournis Tampon d'extraction (EX-1) 5.1.2 Matériel additionnel et équipements spéciaux requis Thermocycleur PCR en temps réel validé par Warnex* * Spécifications du thermocycleur : capacité d'analyser une microplaque « low profile » de 96-puits ou 96 tubes PCR « low profile » de 0,2 ml, capacité d'exciter des fluorophores ayant un pic d'excitation autour de 485 à 520 nm, et capacité de détecter des fluorophores ayant un pic d'émission autour de 500 à 600 nm 5.2 Amorces PCR, programmes des cycles de température, tampons et réactifs 5.2.1 Amorces PCR Les amorces et les phares moléculaires sont fournis dans chaque trousse de détection et leur spécificité pour E. coli a été vérifiée (8.2). 5.2.2 Programmes des cycles de température Les programmes des cycles de température de la réaction PCR incluent un cycle automatisé d'extraction de 15 minutes favorisant la lyse des cellules bactériennes suivi d'un programme automatisé de détection. L'étape de la détection (amplification) est prédéterminée par le programme du thermocycleur pour les paramètres suivants : Amplification : 1 cycle de : 40 cycles de : 5.2.3 Tampons et réactifs Tous les tampons et les réactifs sont fournis par Warnex diagnostiques inc. dans chaque trousse. Ceci inclut les tampons et réactifs d'extraction (EX-1, EX-2) ainsi que les tampons et réactifs de détection (DT-1, DT-2). Tous les autres réactifs requis pour la détection des pathogènes sont déjà pré-distribués dans les puits de la plaque de détection. L'eau, les pipettes, les embouts de pipette et tout le matériel entrant en contact avec les échantillons ou les réactifs PCR temps réel devraient être stériles et sans ADNase. 6. PROCÉDUREPréparer et enrichir les échantillons selon la méthode de culture traditionnelle pour l'isolement de E. coli (8.1) ou par toute autre méthode validée pour l'identification qualitative ou quantitative de E. coli, ou préparer et enrichir les échantillons selon la méthode Warnex décrite dans la section 6.1 pour l'identification semi-quantitative de E. coli au-dessus ou en dessous d'une valeur seuil prédéterminée. Prélever une portion du bouillon d'enrichissement, extraire l'ADN à l'aide du tampon d'extraction et le soumettre à la procédure PCR avec le système Warnex. La procédure Warnex est effectuée selon les instructions suivantes : (Note : Les cycles de température du système PCR et les tampons et réactifs spécialisés sont décrits dans la Section 5). 6.1 Manipulation des échantillons6.1.1 Déposer 10 (11) g ou ml de l'échantillon dans un sac « stomacher » avec filtre dans 90 (99) ml d'eau peptonée. 6.1.2 Homogénéiser le contenu du sac en utilisant un appareil « stomacher ». 6.1.3 Se référer à la notice de produit pour déterminer le choix de milieu de culture (TSA, TSB) ainsi que le volume applicable d'homogénat à inoculer. 6.1.4 Inoculer deux (2) tubes avec le volume d'homogénat indiqué dans la notice de produit. Placer le reste de l'homogénat de l'échantillon au réfrigérateur pour une utilisation ultérieure, au cas où une confirmation s'avérerait nécessaire. 6.1.5 Incuber le TSA/TSB à 35ºC pendant 18-24 heures, en position inclinée pour le TSA. 6.1.6 Après l'incubation, ajouter 2 ml d'eau peptonée stérile dans chaque tube de TSA à l'aide d'une pipette sérologique de 2 ml (ne s'applique pas au TSB). 6.1.7 Vortexer brièvement pour remettre les cellules en suspension. 6.1.8 Transférer 1 ml de chaque suspension de cellules provenant des tubes de culture dans des tubes de 2 ml à l'aide d'une pipette sérologique de 2 ml. 6.2 Extraction de l'ADN6.2.1 Vider le contenu de la bouteille EX-1 (bouteille de plastique souple) dans la fiole EX-2 pour obtenir la solution EX-2 reconstituée. Refermer la fiole et agiter par inversion pour assurer la dissolution complète du réactif déshydraté. Verser la solution EX-2 reconstituée dans un bassin pour pipette à multi-canaux. 6.2.2 Aliquoter 90 μl de la solution EX-2 reconstituée dans chaque puits de la plaque d'extraction de 96 puits (un puits par extraction). 6.2.3 Transférer 10 μl de la suspension de cellules de l'étape 6.1.8 (suspension TSA ou TSB) dans les puits de la plaque d'extraction à l'aide d'une micro-pipette à canal simple, selon le schéma prédéterminé. 6.2.4 Sceller les puits de la plaque d'extraction avec les bandes de bouchons fournies. 6.2.5 Placer la plaque d'extraction dans le thermocycleur et fermer le couvercle. 6.2.6 Débuter le programme d'extraction de l'ADN du thermocycleur. 6.2.7 Lorsque le programme d'extraction est complété, retirer la plaque d'extraction. 6.2.8 Tous les microorganismes sont maintenant lysés et inactivés. 6.2.9 Centrifuger la plaque d'extraction pendant 5 minutes à 1800 x g. 6.2.10 Le surnageant peut maintenant être utilisé pour la méthode de détection (amplification) par PCR. 6.3 Méthode de détection (amplification) par PCR6.3.1 Vider le contenu de la bouteille DT-1 (bouteille de plastique souple) dans la fiole DT-2 pour obtenir la solution DT-2 reconstituée. Refermer la fiole et agiter par inversion pour assurer la dissolution complète du réactif déshydraté. Verser la solution DT-2 reconstituée dans un bassin pour pipette à multi-canaux. 6.3.2 Prendre une plaque de détection et la retirer de l'enveloppe. 6.3.3 Aliquoter 15 μl de la solution DT-2 reconstituée dans la plaque de détection de 96 puits à l'aide d'une pipette multi-canaux. 6.3.4 Transférer 10 μl d'extrait d'ADN provenant de chaque puits de la plaque d'extraction dans les puits de la plaque de détection. 6.3.5 Sceller la plaque d'extraction en utilisant les scellants fournis et entreposer la plaque à 4°C jusqu'à ce que l'analyse soit complétée. 6.3.6 Sceller la plaque de détection avec les bandes de bouchons optiques pour PCR. 6.3.7 Vortexer la plaque de détection pendant 1 minute. 6.3.8 Centrifuger la plaque de détection pendant 1 minute à 1800 x g. Cette étape est nécessaire pour s'assurer que les réactifs PCR ainsi que l'échantillon d'ADN se retrouvent bien au fond des puits de la plaque PCR. 6.3.9 Bien fixer la plaque de détection dans l'appareil PCR. S'assurer que le puits A1 se retrouve dans le coin supérieur gauche. Fermer le couvercle de l'appareil PCR et sélectionner l'icône « Start Detection » pour débuter le protocole d'analyse. 6.3.10 Lorsque le programme de détection sera complété, enlever la plaque de l'appareil et la jeter. 7. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATSL'amplicon (produit de la réaction PCR) généré par la présente méthode PCR est un fragment d'ADN double brin. Lors d'un résultat PCR positif, la réponse mesurée par fluorescence sera plus élevée que celle du seuil de référence exprimé par les témoins négatifs en moins de 40 cycles d'amplification de la réaction PCR. La valeur du seuil de référence de la fluorescence est déterminée et établie par l'appareil PCR. Un résultat négatif n'émettra normalement pas de fluorescence. S'il y a émission de fluorescence au-dessus de la valeur du seuil de référence dans les témoins négatifs, les résultats du test ne sont pas valides et l'analyse doit être reprise après avoir pris soin d'éliminer toutes les sources d'erreur possibles. Tout échantillon trouvé positif au moyen de la technique PCR de Warnex doit être confirmé en procédant à une culture, surtout si des mesures de conformité sont prévues. 7.1 Résultat qualitatifUn signal PCR positif indique la présence de E. coli dans l'échantillon analysé. 7.2 Résultat semi-quantitatifL'interprétation du résultat semi-quantitatif est déterminée en fonction des résultats de présence ou absence de E. coli dans chaque paire de sous-échantillons inoculés au volume spécifié dans la notice de produit pour une valeur seuil ciblée. Se référer au tableau 1, Directives pour l'interprétation des résultats selon les valeurs seuils les plus communes, pour déterminer le niveau de contamination de l'échantillon analysé. Tableau 1. Directives pour l'interprétation des résultats selon les valeurs seuils les plus communes
8. RÉFÉRENCES 8.1 Christensen, D., C. Crawford et R. A. Szabo. 2002. Dénombrement des coliformes, des coliformes fécaux et des E. coli dans les aliments au moyen de la méthode NPP (MFHPB-19). Volume 2, Compendium de méthodes, Santé Canada, Ottawa. Publié sur le site web de la Direction des aliments (Santé Canada) à : 8.2 Warnex recherche inc. 2003. Validation de la technique PCR en temps réel pour l'identification rapide de E. coli dans les aliments et les ingrédients alimentaires. (Données non publiées) ![]() |
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Mise à jour : 2006-01-09 | ![]() |