Méthode de laboratoire
MFLP-35
juin 2002
(Version PDF)
DÉTECTION DE SALMONELLA SPP
PAR LA MÉTHODE D'IMMUNO-ESSAI VISUEL (IEV) SALMONELLA TECRA®
Division de l'évaluation
Bureau des dangers microbiens
Direction des aliments, Santé Canada
Indice d'adresse : 2204A1
Ottawa (Ontario) K1A 0L2
Courriel : don_warburton@hc-sc.gc.ca
- APPLICATION
La présente méthode s'applique à la détection de Salmonella dans les produits ou ingrédients
alimentaires et les échantillons environnementaux, afin de déterminer le niveau d'observation des exigences
stipulées aux articles 4 et 7 de la Loi sur les aliments et drogues.
L'Immuno-essai visuel (IEV) Salmonella de Tecra® utilise une technique de dosage
immunoenzymatique (ELISA) qui permet un dépistage in vitro rapide et spécifique servant à repérer, après
enrichissement sélectif, la présence de Salmonella dans les produits alimentaires et les
échantillons environnementaux. Les résultats sont déterminés de façon visuelle ou à l'aide d'un lecteur à
plaque à microtitration.
Les résultats présumés positifs doivent être confirmés à l'aide d'une méthode acceptée d'ensemencement
sur gélose. Ce point est particulièrement important dans les situations de retraits de produits du marché.
La méthode IEV Salmonella de Tecra® a été approuvée, à titre de méthode officielle, par la
Association of Official Analytical Chemists (AOAC) pour utilisation avec plusieurs milieux d'enrichissement
(méthodes 989.14 et 998.09 de la AOAC). La méthode a aussi été approuvée dans plusieurs pays, notamment la
France, l'Australie, la Nouvelle-Zélande, le Danemark et le Brésil.
- PRINCIPE
L'Immuno-essai visuel (IEV) Salmonella de Tecra® utilise des anticorps à haute affinité dans sa
technique immunoenzymatique en « sandwich ». Ces anticorps de « capture », spécifiques au
Salmonella, ont été adsorbés sur la surface des cupules de microtitration. Les anticorps capturent
les antigènes de Salmonella présents dans l'échantillon. Tout autre matériel présent dans
l'échantillon est éliminé au lavage. L'ajout d'un conjugué anticorps-enzyme spécifique au
Salmonella complète le « sandwich ». La présence du Salmonella dans les échantillons est
démontrée si le conjugué lié donne au substrat une couleur verte. Aucune couleur n'est développée en
l'absence de Salmonella. La période totale de l'analyse, y compris les étapes d'enrichissement
sélectif et de post-enrichissement dans un bouillon M, est de 42 à 50 heures.
Un résultat présumé positif pour le Salmonella obtenu par la technique IEV doit être confirmé
par ensemencement du bouillon d'enrichissement sur des plaques à gélose sélective.
TECRA® est une marque de commerce enregistrée de TECRA International Pty Ltd.13 Rodborough Rd, Frenchs
Forest, NSW 2086, Australie.
- DÉFINITIONS
Voir l'annexe A du volume 3.
- 3.1. Prélèvement des échantillons
Voir l'annexe B du volume 3.
- 3.2. Rigueur de l'échantillonnage
Voir la méthode MFHPB-20 et appliquer, le cas échéant.
- 3.3. Plans d'échantillonnage pour analyse « régulière » et pour analyse « à des fins d'enquête »
Voir la méthode MFHPB-20 et appliquer, le cas échéant.
- MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENTS SPÉCIAUX
- 4.1 Trousse d'analyse :
Tous les réactifs nécessaires pour l'analyse Immuno-essai visuel (IEV)
Salmonella de Tecra® font partie d'une seule trousse contenant le matériel
nécessaire pour effectuer un maximum de 94 déterminations (la trousse compte 96 cupules, mais les
témoins positif et négatif insérés dans la trousse doivent être utilisés pour chaque analyse). Les
trousses sont disponibles en Amérique du Nord chez International Bioproducts Inc., 21312
30th Drive SE, Bothell WA 98021.
- Instructions, feuille de travail
- Porte-plaque
- Languette refermable
- Cupules de microtitration enrobées d'anticorps
- Réactif 1 - Concentré de lavage
- Réactif 2 - Témoin positif
- Réactif 3 - Diluant pour le témoin
- Réactif 4 - Conjugué
- Réactif 5 - Diluant pour le conjugué
- Réactif 6 - Substrat
- Réactif 7 - Diluant pour le substrat
- Réactif 8 - Solution d'arrêt de réaction
- 4.2 Matériel supplémentaire :
- Incubateur capable de maintenir des températures de 35 à 37 °C
- Incubateur capable de maintenir des températures de 41 à 43 °C
- Pipettes sérologiques
- Flacon pressable en plastique
- Pipettes (20 µL, 50 µL et 200 µL)
- Film étirable
- Bain-marie (100 °C)
- Bouteilles ou tubes à bouchon à vis capables de contenir un volume de 5 mL et pouvant
supporter l'ébullition.
- Mélangeur à vortex
- Éprouvettes en verre (15 cm x 15 cm)
- Mélangeur/Stomacher/sacs adaptés au Stomacher
- 4.3 Milieux de culture (IEV)
Les milieux, disponibles sur le marché, doivent être préparés et stérilisés conformément aux
instructions du fabricant. Voir aussi l'annexe G du volume 3 et la référence 8.2 pour la formule de
composition de chaque milieu.
Nota: Si l'analyste utilise toute variation des milieux énumérés dans le présent
document (produit disponible sur le marché ou préparé sur place), il incombe à l'analyste ou au
surveillant du laboratoire d'en assurer l'équivalence.
Bouillons d'enrichissement :
Différents protocoles d'enrichissement sont décrits dans le manuel des méthodes TECRA inséré dans
chaque trousse.
Protocole 1 : Méthode de la AOAC 998.09 Option 1 RV(R10)/TT
Bouillon lactosé ou tout autre bouillon non inhibiteur précisé par la FDA BAM
(pré-enrichissement)
Bouillon de tétrathionate et bouillon Rappaport Vassiliadis (RV-R10) (enrichissement sélectif)
Bouillon M (post-enrichissement)
Protocole 2 : Méthode de la AOAC 998.09 Option 2 (RV/R10)
Tel que le protocole 1, mais en utilisant seulement le bouillon Rappaport Vassiliadis (RV/R10) -
(enrichissement sélectif)
Protocole 3 : Méthode de la AOAC 998.09 Option 3 TT
Tel que le protocole 1, mais en utilisant seulement le bouillon de tétrathionate (enrichissement
sélectif)
Protocole 4 : Méthode de la AOAC 989.14 TT/SC
Bouillon lactosé ou tout autre bouillon non inhibiteur précisé par la FDA BAM (pré-enrichissement)
Bouillon de tétrathionate et bouillon de Selenite Cystine (enrichissement sélectif)
Bouillon M (post-enrichissement)
Protocole 5 : Méthode approuvée par l'AFNOR
Eau peptonée tamponnée (pré-enrichissement)
Bouillon Rappaport Vassiliadis (RV/R10) et bouillon de Mannitol Selenite Cystine (MSC) ou bouillon
de Selenite Cystine (SC) (enrichissement sélectif)
Bouillon M (post-enrichissement)
Nota: Il incombe à chaque laboratoire de veiller au maintien de la température
recommandée des incubateurs et des bains-marie.
- PROCÉDURE
- 5.1 Manipulation des unités d'échantillonnage
- 5.1.1 Analysez les échantillons aussitôt que possible. Si nécessaire, entreposez les
échantillons dans des conditions de temps et de température qui empêchent la croissance ou la
mort de la microflore endogène. Si les unités d'échantillonnage ont été mal entreposées en
transit, il est préférable de prélever de nouveaux échantillons.
- Aliments congelés : les unités d'échantillonnage qui présentent aucun signe de dégel au
moment de leur réception peuvent être entreposés au congélateur à des températures variant
entre -10 ºC et -20 ºC.
- Aliments secs et stables à température ambiante : entreposez les unités
d'échantillonnage à la température ambiante.
- Tous les autres aliments, y compris ceux qui sont reçus dans des conditions de dégel
partiel : réfrigérez les unités d'échantillonnage et analysez-les aussitôt que possible, de
préférence dans les 24 heures suivant leur réception.
- 5.1.2 Dégelez les échantillons gelés à la température ambiante dans les 60 minutes qui suivent; si
cela est impossible, dégelez les échantillons dans un réfrigérateur dont la température est maintenue entre
2 ºC et 8 ºC.
Nota: a) Les échantillons de taille importante(p. ex., une dinde entière) ne dégèlent pas facilement au réfrigérateur. Pour accélérer le processus, placez l'échantillon congelé dans un sac de papier à parois épaisses et dégelez l'échantillon à la température ambiante pendant la nuit. Cette technique garde froide la surface du produit durant le processus de dégel.
b) Utilisez les contenants recommandés pour éviter que l'exsudation du produit contamine le laboratoire.
- 5.1.3 Si le volume de l'unité d'échantillonnage reçue est inférieur à l'unité analytique
recommandée, analysez toute l'unité et enregistrez le poids utilisé.
- 5.1.4 Le mélange des échantillons doit être limité à la période minimale requise pour
produire une suspension homogène. Un mélange excessif peut physiquement endommager l'échantillon
et avoir des effets néfastes sur la microflore endogène.
Pour ce qui est des unités d'échantillons reçus sous forme homogène, placez le volume de
l'unité analytique dans le bouillon de pré-enrichissement
- 5.1.5 Utilisez des techniques d'asepsie et du matériel stérile durant toutes les étapes de
l'analyse. Durant l'étape de manipulation, il est crucial de confiner les produits pulvérulents
pour éviter toute contamination croisée de l'aire de travail.
- 5.2 Enrichissement
Les échantillons doivent être enrichis selon le protocole d'enrichissement approprié décrit ans
le manuel des méthodes d'immuno-essai visuel (IEV) Salmonella de Tecra®. La température des
bouillons d'enrichissement doit se situer entre 20 °C et 25 °C avant d'y incorporer les
échantillons. Pour les échantillons dont le volume d'analyse est supérieur à 225 mL, il faut
préchauffer le bouillon avant d'ajouter l'échantillon.
- 5.3 Analyse
Suite au post-enrichissement dans un bouillon M, les échantillons doivent être détruits par la
chaleur et analysés à l'aide de la trousse IEV, conformément au manuel d'instruction d'immuno-essai
visuel de Tecra®. L'immuno-essai dure environ 2 heures et les réactions de chaque cupule peuvent
être lues à l'oeil nu ou à l'aide d'un spectrophotomètre.
- 5.4 Confirmation par ensemencement sur gélose
Les échantillons qui présentent un résultat positif par immuno-essai visuel Salmonella
de Tecra® doivent être confirmés. À partir du bouillon M ou d'un bouillon d'enrichissement sélectif,
ensemencez une plaque de gélose sélective standard et effectuez les analyses biochimiques et
sérologiques recommandées.
- RÉFÉRENCES
- 6.1 Denise Hughes, Angela Daillianis et Louise Hill 1999. Salmonella in Foods - A
New Enrichment Procedure for Use with the TECRA Salmonella Visual Immunoassay : Collaborative Study
J.AOAC Int. 82 : 634 à 647
- 6.2 Commission internationale pour la définition des caractéristiques
microbiologiques des aliments (ICMSF).1986. Microorganisms in Foods 2. Sampling for microbiological
analysis: Principles and Specific applications. Deuxième édition. University of Toronto Press, Toronto
(Ontario).
- 6.3 US Food and Drug Administration. 1995. Bacteriological Analytical manual
(8è éd.) AOAC International, Gaithersburg, Md.
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