DÉNOMBREMENT DES LEVURES ET DES MOISISSURES DANS LES ALIMENTS
MFHPB-22
Janvier 2004
(Version PDF)
DIRECTION GÉNÉRALE DES PRODUITS DE SANTÉ ET DES ALIMENTS
OTTAWA
Donna Douey
Laboratoire de Calgary
Agence canadienne d'inspection
des aliments (ACIA)
3650 36 St. N.W.
Calgary (Alb.) T2L 2L1
doueyd@inspection.gc.ca
Patti Wilson
Laboratoire de Dartmouth
Agence canadienne d'inspection
des aliments (ACIA)
C.P. 1060
Dartmouth, NS, B2Y 3Z7
wilsonpa@inspection.gc.ca
Division de l'évaluation
Bureau des dangers microbiens
Direction des aliments, Santé Canada
Repère postal : 2204A1
Ottawa (Ontario) K1A 0L2
Tableau des matières
- APPLICATION
- PRINCIPLE
- DEFINITION OF TERMS
- COLLECTION OF SAMPLES
- MATERIALS AND SPECIAL EQUIPMENT
- PROCEDURE
- REFERENCES
- TABLE I - Treatment of Food Suspensions
- TABLE II - Examples for Recording Results
1. APPLICATION
La présente méthode s'applique au dénombrement des levures et des moisissures viables dans les aliments et les ingrédients alimentaires afin de déterminer s'il y a conformité avec les articles 4 et 7 de la Loi sur les aliments et drogues. Cette version révisée remplace la méthode MFHPB-22 datée de mars 2002.
2. PRINCIPE
Par le passé, des milieux acidifiés étaient utilisés pour dénombrer les levures et les moisissures dans les aliments. On considère maintenant que ces milieux sont inférieurs aux milieux qui contiennent des antibiotiques et qui sont conçus pour supprimer le développement de colonies bactériennes, améliorer la revivification des levures et des moisissures endommagées et minimiser la précipitation des particules d'aliments.
Un milieu, contenant des éléments nutritifs nécessaires à la croissance de la plupart des levures et des moisissures et des antibiotiques qui inhibent le développement de la plupart des bactéries, est ensemencé avec une quantité donnée du produit à analyser. On incube à une température de 22 à 250C pendant 3 à 5 jours. Les colonies qui apparaissent dans le milieu de culture sont ensuite dénombrées et/ou examinées. La méthode décrite ici est une méthode « pour usage général » et il se peut qu'elle ne convienne pas à la détection de levures et de moisissures qui se sont adaptées à certains types d'aliments, comme les aliments dont la valeur de l'activité hydrique est faible.
3. DÉFINITIONS DES TERMES
3.1 Voir l'Annexe A du volume 2
3.2 Xérophile : Moisissures qui préfèrent une activité hydrique réduite pour se multiplier.
3.3 Osmophile : Levures qui préfèrent une activité hydrique réduite pour se multiplier
PRÉCAUTIONS
Certaines levures et moisissures peuvent être infectieuses ou causer des réactions allergiques. C'est pourquoi il importe d'être vigilant lorsqu'on travaille avec ces organismes. Idéalement, il faudrait garder les boîtes de Pétri dans un incubateur et non dans une pièce ouverte. Les couvercles des boîtes ne devraient généralement être enlevés que pour des opérations comme la préparation d'une lame pour l'examen microscopique. Avant de procéder aux transferts, il faut laisser refroidir les aiguilles passées à la flamme afin d'éviter de disperser les conidies et autres cellules. Éviter d'inhaler les spores at autres produits des moisissures tels que les volatiles (ne pas sentir).
4. PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS
Voir l'annexe B du volume 2
5. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENTS SPÉCIAUX
Les milieux et bases de milieu suivants (1 à 5) sont disponibles sur le marché et ils doivent être préparés et stérilisés selon les instructions du fabricant. Voir aussi l'annexe G du volume 2 et la référence 7.2 pour la formulation des milieux individuels.
NOTE : Il incombe à chaque laboratoire de s'assurer que les incubateurs ou les bains-marie sont maintenus à la température recommandée. Lorsqu'on recommande 35 0C, l'incubateur peut être réglé à 35 ±1 0C. De même, une température plus basse de 30 ou 25 0C peut être réglée à 35 ±1 0C. Toutefois, lorsqu'on recommande des températures plus élevées, comme 43 ou 45,5 0C, il est impératif de maintenir les incubateurs ou les bains-marie à la température indiquée à ±0,5 0C parce que les températures plus élevées peuvent être létales pour le micro-organisme qu'on cherche à isoler.
Géloses et diluants pour usage général
1) Gélose dichloran-rose Bengale-chloramphénicol (DRBC)
2) Gélose pour dénombrement en plaque avec chloramphénicol (PCA-C)
3) Gélose de pomme de terre et dextrose avec chloramphénicol (PDA-C)
4) Gélose de pomme de terre, de dextrose et de sel avec chloramphénicol (PDSA-C) (pour analyse des moisissures « envahissantes »)
5) Gélose dichloran-glycérol (DG-18) (pour les moisissures xérophiles)
6) Gélose d'extrait de malt contenant 50 % (p/p) de sucrose (pour les aliments à forte teneur en sucre tel que le miel)
7) Eau peptonée (0,1 %) (EP)
8) Eau peptonée (0,1 %) avec du sucrose à 20% (P/V) - diluant pour les aliments à forte teneur en sucre tel que le miel
9) Citrate de sodium à 2 % tempéré à 45 0C (diluant pour les aliments à forte teneur en matière grasse comme le fromage)
Matériel :
10) Bâtons stériles pour l'étalement
11) Colorant au violet de cristal
12) Stomacher, mélangeur ou l'équivalent
13) Microscope optique
14) Compteur de colonies (facultatif)
15) Incubateur capable de maintenir une température de 22 à 250C
16) Bain-marie à 450C, tel que requis pour tempérer la gélose et/ou pré chauffer le citrate de sodium
NOTE : Il incombe à chaque laboratoire de s'assurer que les incubateurs ou les bains-marie sont maintenus à la température recommandée. Lorsqu'on recommande 35 0C, l'incubateur peut être réglé à 35 ±1 0C. De même, une température plus basse de 30 ou 25 0C peut être réglée à 35 ±1 0C. Toutefois, lorsqu'on recommande des températures plus élevées, comme 43 ou 45,5 0C, il est impératif de maintenir les incubateurs ou les bains-marie à la température indiquée à ±0,5 0C parce que les températures plus élevées peuvent être létales pour le micro-organisme qu'on cherche à isoler.
6. MARCHE À SUIVRE
Chaque unité d'échantillonnage peut être analysée individuellement ou les unités d'échantillonnage peuvent être combinées lorsque les exigences du plan d'échantillonnage applicable sont rencontrées. L'épreuve doit être effectuée conformément aux instructions suivantes:
6.1 Manipulation des unités d'échantillonnage
6.1.1 Pendant l'entreposage et le transport, à l'exception des aliments stables à la température de la pièce, garder les unités d'échantillonnage au réfrigérateur (0-50C). Il faut garder au congélateur les unités d'échantillonnage de produits congelés.
6.1.2 Faire dégeler les échantillons congelés dans un réfrigérateur ou pendant une période et à une température qui empêchent la croissance ou la mort des micro-organismes.
6.1.3 Analyser les unités d'échantillonnage le plus tôt possible après leur arrivée au laboratoire.
6.2 Préparation pour l'analyse
6.2.1 Préparer les milieux appropriés correspondant à l'analyse effectuée. Avant usage, s'assurer que les boîtes de géloses pré-versées sont sèches en les laissant sécher pour la nuit à la température ambiante ou d'une autre façon appropriée (par exemple, dans une hotte biologique ou une hotte à flux laminaire jusqu'à ce que les géloses soient sèches). Tempérer la gélose pour la gélose coulée en boîtes.
| NOTE : La gélose DRBC ne doit pas être exposée à la lumière, car la photo-dégradation du rose Bengale produit des composés toxiques pour les levures et les moisissures. |
6.2.2 Nettoyer la surface de travail avec un désinfectant approprié.
6.2.3 Marquer clairement les boîtes de Pétri, préparées en double, en identifiant l'échantillon, l'unité d'échantillonnage, la dilution ou la date d'ensemencement tel que requis pour l'identification.
6.3 Préparation des échantillons
6.3.1 Préparer de l'eau peptonée à 0,1 % comme diluant. Il faudrait ajouter au diluant un soluté approprié, par exemple du sucrose à 20 %, pour le dénombrement des micro-organismes osmophiles dans des aliments comme des sirops et des jus de fruits concentrés. On peut en outre utiliser une solution de citrate de sodium à 2 %, préchauffée à 45 0C, pour diluer des aliments à forte teneur en matière grasse comme le fromage.
6.3.2 Pour obtenir une unité d'analyse vraiment représentative, agiter les liquides et les matières fluides jusqu'à ce que le contenu soit homogène. Dans le cas d'un solide, obtenir l'unité d'analyse en prélevant une portion à différents endroits dans l'unité d'échantillonnage.
6.3.3 Il peut être avantageux de laisser tremper pendant un certain temps les aliments secs ou mi-secs pour récupérer les levures et les moisissures. Le trempage peut permettre la réparation de cellules endommagées. Réhydrater les aliments secs pendant 30 à 60 minutes avec un volume égal d'eau peptonée, à la température de la pièce.
6.3.4 Préparer une dilution à 1:10 de l'aliment en pesant, de façon aseptique, 25 g ou ml (l'unité d'échantillonnage) dans 225 ml du diluant requis, tel indiqué au tableau I. Si un aliment sec a été trempé tel que décrit à la section 6.3.3, préparer une dilution à 1:5 de cette dilution 1:2, ce qui résulte en une dilution 1:10. Si la taille de l'échantillon diffère de 25 g ou ml, maintenir le ratio 1:10 entre l'échantillon et le diluant, comme 11 (10) g ou ml dans 99 (90) ml.
| NOTE : Le poids ou le volume entre parenthèses indique une autre façon de préparer les dilutions. |
6.3.5 Passer au stomacher ou au mélangeur, ou agiter selon le type d'aliment de la façon indiquée au tableau 1.
Homogénéiser l'échantillon en utilisant un stomacher pendant 2 minutes. Alternativement, passer au mélangeur pendant 1 minute, bien que l'usage d'un stomacher soit préférable. Dans le cas des aliments qui ont tendance à mousser, régler le mélangeur ou le stomacher à basse vitesse et prélever une portion aliquote sous l'interface liquide-mousse.
6.3.6 Si la dilution 1:10 est préparée dans une bouteille de dilution, il faut agiter la bouteille à 25 reprises en suivant un arc de 30 cm pendant environ 7 secondes.
6.3.7 Préparer au besoin des dilutions décimales successives en utilisant une pipette stérile différente pour effectuer chaque transfert.
6.4 Ensemencement
6.4.1 Les moisissures qui ont subi un stress devraient être dénombrées par la technique d'étalement en surface de gélose plutôt que la technique de gélose coulée en boîte. Cette technique permet de maximiser l'exposition des cellules à l'oxygène atmosphérique et d'éviter le stress thermique causé par la gélose fondue.
6.4.2 La technique de gélose coulée en boîte peut être utilisée pour la détection des levures ou des moisissures non-stressées. Les géloses coulées en boîte peuvent être utilisées pour toutes les moisissures à la discrétion du laboratoire et si l'on a validé que les dénombrements ne présentent pas de différence significative entre les géloses étalées en surface et les géloses coulées en boîte.
6.4.3 Agiter chaque bouteille de dilution pour remettre en suspension les matières qui pourraient s'être déposées au cours de la préparation. Comme les spores de moisissure peuvent se déposer en quelques minutes, il est important d'agiter toutes les dilutions (comme en 6.3.6) immédiatement avant d'effectuer le transfert pour assurer que les micro-organismes présents sont distribués de façon uniforme.
6.4.4 Géloses étalées en surface
Pour chaque dilution préparée, étaler 0,1 ml en double sur le milieu approprié avec un bâton stérile. Afin de faciliter le dénombrement de faibles populations de levures, étaler 0,25 ml des dilutions 100 ou 10-1 pour les aliments qui sont respectivement liquides ou solides.
6.4.5 Géloses coulées en boîte
Pipetter 1,0 ml ou 0,1 ml à partir des dilutions requises dans des boîtes de Pétri en double correctement identifiées. Verser au moins 15 ml de gélose tempérée dans chaque boîte, et mélanger en tournant et inclinant les boîtes. Laisser la gélose se solidifier. Il faut verser le milieu dans les boîtes au plus tard 15 minutes après la préparation des dilutions.
6.5 Incubation
Incuber les boîtes de gélose à l'endroit, sans les bouger, à une température de 22 à 25 0C pendant 3 à 5 jours. Les levures osmophiles peuvent être incubées jusqu'à 7 jours. Normalement, compter les colonies après 5 jours d'incubation. Examiner les boîtes après 3 jours et si les colonies de moisissures sont nombreuses, il faut alors les dénombrer et procéder à un nouveau dénombrement le cinquième jour si possible. Manipuler les boîtes le moins possible pendant le dénombrement le troisième jour, de façon à ne pas déloger les spores et à éviter une croissance secondaire.
6.6 Dénombrement des colonies et examen de la croissance
6.6.1 Compter les colonies et distinguer au besoin les colonies de levures des colonies de moisissures en fonction de leur morphologie. Il peut être nécessaire d'examiner au microscope des frottis colorés au violet de cristal afin de distinguer les colonies de levures de certaines colonies bactériennes qui peuvent ressembler à des levures. A l'examen microscopique, les cellules de levures sont plus larges de façon significative par rapport aux bactéries et peuvent présenter un bourgeonnement.
6.6.2 Choisir, si possible, les boîtes qui contiennent de 10 à 150 colonies. Déterminer au microscope l'identité des colonies en tête d'épingle. Si le nombre de colonies ne se situe pas entre 10 et 150, choisir les boîtes dont le compte se rapproche le plus de cette plage. Si la mycoflore est constituée principalement de moisissures, choisir les boîtes où la plage de population est la plus faible. S'il s'agit principalement de levures, dénombrer la limite supérieure.
Ou, 6.6.3 Si les boîtes contiennent des colonies envahissantes, choisir si possible une zone représentative, libre de ces envahisseurs, et dénombrer les colonies dans cette zone. On estime le nombre total de colonies sur toute la boîte en multipliant le nombre de colonies de la zone représentative par l'inverse de la fraction de la boîte dénombrée. Par exemple, si l'on obtient 30 colonies sur un quart de la surface de la boîte, le nombre total sera alors : 30 x 4 = 120 colonies. Les résultats sont exprimés comme un compte estimé.
6.7 Différentiation entre les colonies et les particules interférentes
6.7.1 Les particules d'aliments dans certaines matrices (par exemple, la viande, le lait en poudre, les oeufs en poudre), nuisent souvent au dénombrement des colonies. On peut régler ce problème en préparant une boîte supplémentaire de chaque dilution contenant des particules interférentes et en gardant cette boîte au réfrigérateur comme témoin pour fins de comparaison pendant le dénombrement.
6.8 Enregistrement des résultats
6.8.1 Pour calculer la numération des levures et moisissures, utiliser la formule: N = A x D, où N représente le nombre de colonies par g (ml) de produit, A. est le dénombrement moyen par boîte et D est le facteur de dilution respectif. Suivre les exemples indiqués au tableau 5-1 du Standard Methods for the Examination of Dairy Products (voir 7.1).
6.8.2 Éviter de donner une fausse impression de précision et d'exactitude dans le calcul du nombre de colonies (tableau II). Arrondir les résultats à deux chiffres significatifs, jusqu'au nombre entier le plus près.
6.8.3 Si la dilution la plus faible ne présente aucune colonie, la valeur qu'il faut rapporter est la moyenne la plus faible que l'on peut obtenir d'un volume donné ensemencé sur un ensemble donné de boîtes en double en faisant précéder cette valeur du signe « moins que » (<). Par exemple, pour un volume de 1 ml et un ensemble de boîtes en double (1 ml/boîte), la valeur est de <0,5. (La plus faible moyenne possible avec une seule colonie sur une des deux boîtes est de :
(1 + 0)/ 2 = 0,5 Cette valeur correspond à une dilution de 100 (facteur de dilution = 1).
Pour les autres dilutions, il faut multiplier la valeur numérique de 0,5 par l'inverse de la dilution, c.-à-d. par le facteur de dilution.
Ex. 1 / 10-1 = 10
Par conséquent, si un volume de 2 ml est ensemencé par la technique de la gélose étalée ou la gélose coulée, la valeur rapportée si aucune levure ou moisissure n'est présente est de < 5 ufc/g (voir tableau 2). Si un volume de 0,2 ml est ensemencé par la technique de la gélose étalée, la valeur rapportée si aucune levure ou moisissure n'est présente est de < 50 ufc/g (voir tableau 2).
7. RÉFÉRENCES
7.1 American Public Health Association (APHA). 1992. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. Chapitre 6. Seizième édition. American Public Health Association, Washington, D.C.
7.2 Atlas, R.M. 1997. Handbook of Microbiological Media. Deuxième édition. L.C. Parks (éditeur). CRC Press Inc.
7.3 Bandler, R., M.E. Stack, H.A. Koch, V.H. Tournas and P.B. Mislivec. 1998. Yeasts, Molds and Mycotoxins. In: FDA Bacteriological Analytical Manual, 8th edition. pp.18.01-18.08.
7.4 Banks, J.G. et R.G. Board. 1987. Some factors influencing the recovery of yeasts and molds from chilled foods. Intl. J. Foods Microbiol. 4:197.
7.5 Beuchat, L.R. et A.D. Hocking. 1990. Some considerations when analysing foods for the presence of xerophilic fungi. J. Food Prot. 53 (11):984-989.
7.6 Beuchat, L.R., B.V.Nail, R. E. Brackett and T. L. Fox. 1990. Evaluation of a Culture Film (Petrifilm TM YM) Method for Enumeration Yeasts and Molds in Selected Dairy and High-Acid Foods. J. Food Prot. 53 (10): 864-874.
7.7 Beuchat, L.R., Y. Yung, D. A.. Golden, J.M. Peinado, P. Gonzalo, T. Deak, T. Keffler, M.I. DeSiloniz and M.J. Valderrama. 1998. An interlab study on the suitability of diluents and arecovery media for enumeration of Zygosaccharomyces rouxii in high sugar foods. J. Food Mycol. 1 (3): 117-130.
7.8 Deak, T. and L.R. Beuchat. 1996. Handbook of Food Spoilage Yeasts. CRC Press Inc.
7.9 Deak, T., J. Chen, D.A. Golden, M.S. Tapia, J. Tornai-Lehoczki, B.C. Viljoen, M.T. Wyder et L.R. Beuchat. Comparison of dichloran 18 % (DG18) agar with general purpose mycological media for enumerating food spoilage yeasts. Int. J. Food Microbiol. 67:49-53.
7.10 International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF). 1978. Microorganisms in foods. Their significance and methods of enumeration. Deuxième édition. p. 157-159, 318-319. Presses de l'Université de Toronto, Toronto.
7.11 Jarvis, B. et A.P. Williams. 1987. Methods for detecting fungi in foods and beverages. Dans : Beuchat, L.R. (éd.), Food and beverage mycology. Deuxième édition. p. 599-636. Avi Publishing Col, Wesport, Connecticut.
7.12 Jarvis, B. 1973. Comparison of and improved rose Bengal-chlortetracycline agar with other media for the selective isolation and enumeration of moulds and yeasts in foods. J. Appl. Bacteriol. 36: 723-727.
7.13 Mislivec, P.B., L.R. Beuchat et M.A. Cousin. 1992. Yeasts and Moulds. Dans : Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, APHA, Washingon D.C. p. 237-249.
7.14 Mossell, D.A.A., C.L. Vega, et H.M.C. Put. 1975. Further studies on the suitability of various media containing antibacterial antibiotics for the enumeration of moulds in food and food environments. J. Appl.Bacteriol. 39: 15-22.
7.15 Samson, R.A., E. S Hoekstra, F. Lund, O. Filtenborg and J.C. Frisvan. 2000. Methods for the Detection, Isolation and Characterisation of Food-borne Fungi. In: Introduction to Food- and Airborne Fungi. Sixth edition. pp. 283-297. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands.
7.16 Samson, R.A., A.D. Hocking, J.I. Pitt and A.D. King. (Eds). 1992. Modern Methods in Food Mycology. Elsevier, Amsterdam.
TABLEAU I
Traitement des suspensions d'aliments
| Type d'aliment |
Préparation |
Traitement |
| Liquides |
|
|
| lait, eau, jus, etc. |
pipetter directement dans le diluant à l'eau peptonée |
agiter |
| liquides visqueux |
peser dans le diluant à l'eau peptonée |
agiter |
| |
|
|
| Solides |
|
|
| solides hydrosolubles |
peser dans le diluant à l'eau peptonée |
agiter |
| poudres, viandes |
peser dans le diluant à l'eau peptonée |
passer au stomacher ou au mélangeur |
| tous les fromages |
peser dans une solution aqueuse de citrate de sodium (Na3C6H5O7.2H 2O) à 2 % pré-chauffée à 450C |
passer au stomacher ou au mélangeur |
| miel (ou autre aliments à forte teneur en sucre) |
peser dans le diluant à l'eau peptonée avec du sucrose à 20% |
passer au stomacher ou au mélangeur |
| épices |
peser dans le diluant à l'eau peptonée |
agiter |
| mollusques |
peser dans le diluant à l'eau peptonée |
passer au stomacher ou au mélangeur |
TABLEAU II
Exemples d'enregistrement des résultats
| Nombre moyen de colonies (exemples) |
Quantité ensemencée |
Dilution |
Nombre de levures et de moisissures par g (ml) |
| entre 10 à 150 : p. ex., 144 |
2 ml |
1:1000 |
140 000 |
| plus de 150 : p. ex., 440 |
2 ml |
Dilution la plus élevée 1:1000 |
440 000 E* |
| moins de 10 : p. ex., 8 |
2 ml |
Dilution la plus faible 1:1000 |
8 000 E |
| aucune colonie |
2 ml |
Dilution la plus faible 1:1000 |
<500 |
* E est un compte estimé
|
