Dénombrement des coliformes, des coliformes
fécaux et des E. Coli dans l'eau en contenants
scellés et dans la glace préemballée au
moyen de la méthode du NPP
Direction générale des produits de santé et des aliments - Ottawa
1. APPLICATION
La méthode du nombre le plus probable (NPP) est
applicable au dénombrement des coliformes, des
coliformes fécaux et des Escherichia coli
aérogènes dans l'eau en contenants
scellés (y compris l'eau minérale et
l'eau de source) et dans la glace
préemballée conformément aux articles
B.12.001, B.12.004 et B.12.005 du Règlement
d'application de la Loi sur les aliments et drogues.
Cette méthode remplace les méthodes MFO-9 et
MFO-15 datées du 30 novembre 1981.
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Note : La présente
méthode ne doit pas servir
à isoler et à dénombrer les
sérotypes d'E. coli qui sont
associées à la maladie humaine, en
particulier le sérotype
entérohémorragique O157:H7. Plusieurs des
sérotypes pathogènes ne donnent pas une
réaction positive à l'épreuve
des coliformes fécaux, si bien que cette
méthode ne permettra pas de les détecter
et de les récupérer.
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2. DESCRIPTION
La technique du NPP fait appel à la méthode de
fermentation en tubes multiples, au cours de laquelle au
moins trois dilutions décimales de
l'échantillon sont ensemencées dans des
éprouvettes de bouillon et incubées à
une température précise, pendant une
période donnée. La méthode est
progressive : il faut d'abord déterminer si les
éprouvettes contiennent des coliformes,
déterminer ensuite si les éprouvettes
contiennent également des coliformes fécaux, et
enfin confirmer s'il y a présence d'E. coli.
Il est possible d'estimer le nombre le plus probable de
micro-organismes présents à l'aide d'un
tableau statistique standard de NPP, selon le nombre
d'éprouvettes indiquant la présence ou
l'absence des trois groupes de micro-organismes.
Il a été démontré que cette
méthode produit des résultats satisfaisants
avec l'eau en contenants scellés (y compris
l'eau minérale et l'eau de source) et la glace
préemballée naturellement contaminées et
artificiellement contaminées lors d'études
de la DGPSA (données non publiées).
2.1 Méthodes équivalentes
Les méthodes MFHPB-17, MFHPB-19 et MFHPB-26,
considérées équivalentes à la
méthode présentée ici, peuvent
être utilisées pour déterminer la
présence ou énumérer les coliformes et
les E. Coli et déterminer la conformité aux
articles de la Loi des aliments et drogues,
énumérées ci-dessus, ainsi qu'au
Tableau III de la présente méthode. On retrouve
ces méthodes dans le Volume 2 du Compendium des
méthodes d'analyse.
3. PRINCIPE
La méthode du NPP permet de déterminer la
présence de coliformes, de coliformes fécaux et
d'E. coli aérogènes dans l'eau. En
bref, cette méthode fait appel à la dilution en
série des micro-organismes cibles dans
l'échantillon, en cinq parties aliquotes,
jusqu'à extinction (8.6). La concentration
probable des micro-organismes cibles est ensuite
estimée statistiquement à l'aide d'un
tableau de NPP.
La production de gaz sert d'indication de la
capacité de fermenter le lactose dans le bouillon LST
(épreuve de la détermination des coliformes
présomptifs). La production de gaz dans le bouillon
BGLB est tenue pour une confirmation de la présence de
coliformes. La production de gaz à 45°C dans le
bouillon EC sert de confirmation de la présence de
coliformes fécaux. Enfin, lorsque les bouillons EC
positifs sont ensemencés sur gélose L-EMB,
l'apparition de colonies nucléées
caractéristiques dont le centre est sombre, avec ou
sans reflets métalliques, indique la présence
d'E. coli. Les colonies caractéristiques sur
gélose L-EMB doivent faire l'objet d'une
confirmation faisant appel à d'autres
épreuves biochimiques visant à démontrer
la présence d'E. coli.
4. DÉFINITIONS DES TERMES
Voir l'Annexe A du volume 1.
5. PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS
5.1 Voir l'Annexe B du volume 1
5.2 Chaque unité d'échantillonnage doit
contenir au moins 500 ml.
5.3 Ne pas laisser décongeler les unités
d'échantillonnage de glace
préemballée pendant le transport.
6. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENTS SPÉCIAUX
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NOTE: Le superviseur de laboratoire
doit s'assurer que l'exécution des
analyses, décrites dans cette méthode,
doit être faite en accord avec la Norme
internationale appelée "ISO/IEC 17025: 1999
Prescriptions générales concernant la
compétence des laboratoires
d'étalonnages et d'essais".
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Les milieux listés ci-bas (1 à 7) sont
disponibles dans le commerce et doivent être
préparés et stérilisés selon les
instructions du fabricant. Voir aussi l'Annexe G du
volume 1 ainsi que la référence citée en
8.7 pour la composition de chaque milieu.
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Note : Si l'analyste utilise des
variantes des milieux indiqués ici (qu'il
s'agisse d'un produit disponible dans le
commerce ou fabriqué à partir
d'ingrédients), il incombe à
l'analyste ou au superviseur du laboratoire
d'en assurer l'équivalence.
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1) Eau peptonée (0,1%)
2) Bouillon tryptosé au lauryl-sulfate (LST)
3) Bouillon lactosé au vert brillant et aux sels
biliaires à 2 % (BGLB)
4) Bouillon d'Escherichia coli (EC) ou Bouillon d'EC
avec MUG (4-méthylumbelliferyl- -D-glucuronide).
5) Gélose à l'éosine et au bleu de
méthylène de Levine (L-EMB) ou gélose
Endo
6) Gélose MacConkey
7) Gélose nutritive (NA) ou autres géloses non
sélectives
8) Bains-marie recouverts dotés d'un
système de circulation afin de maintenir la
température à 45°C. Le niveau d'eau
doit être au-dessus du milieu contenu dans les
éprouvettes immergées.
9) Thermomètre étalonné et
homologué
10) Incubateur, 35°C.
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NOTE : Il incombe à chaque laboratoire de
s'assurer que les incubateurs ou les bains-marie
sont maintenus à la température
recommandée. Lorsqu'on recommande 35 °C
dans le texte de la méthode, l'incubateur
peut être à 35 ± 1,0 °C. De
même, des températures plus basses
à 30 oC ou à 25 oC peuvent être
à ± 1,0 °C près. Toutefois,
lorsqu'on recommande des températures plus
élevées, comme 43 oC ou 44,5 °C, il
est impératif de maintenir la température
des incubateurs à ± 0,5 oC près,
et celle des bains-marie, à ± 0,2 °C
près. Des températures plus
élevées peuvent être létales
pour le micro-organisme qu'on cherche à
isoler.
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11) Cultures témoins (utiliser des cultures ATCC ou
l'équivalent) :
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témoin(s) positif(s) :
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E. coli qui peut produire du gaz à 45 oC et peut
fermenter le lactose et produire des réactions
caractéristiques sur gélose L-EMB; si
l'on utilise du bouillon EC-MUG, une souche qui
peut produire de la -glucuronidase
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témoin négatif pour EMB/IMViC :
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Enterobacter aerogenes ou un bâtonnet Gram
négatif équivalent qui ne donne pas de
réactions « positives » sur
gélose EMB et ne produit pas d'indole, donne
une réaction négative à
l'épreuve au rouge de méthyle, une
réaction positive à l'épreuve
de Voges-Proskauer et une réaction positive
à l'épreuve ou citrate.
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témoin négatif pour bouillons NPP :
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Salmonella berta ou un bâtonnet Gram
négatif équivalent qui est négatif
pour la production de gaz dans les bouillons NPP et
dans le deuxième bouillon EC.
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NOTE : Certaines souches d'E.
aerogenes donnent des réactions faussement
positives dans les bouillons NPP (LST, BGLB et EC) en
produisant une petite bulle de gaz. C'est pourquoi
il faut utiliser S. berta ou une culture
équivalente pour ces bouillons et E. aerogenes
ou une culture équivalente pour la gélose
EMB et les épreuves IMViC.
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12) Produits nécessaires à la confirmation
(disponibles dans le commerce) :
On peut avoir besoin des produits suivants pour la
confirmation : utiliser A ou B (voir 7.7). Le choix
d'autres méthodes d'identification (7.7.5)
peut demander d'autres milieux.
A. Milieux IMViC et réactifs :
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Bouillon de tryptone (ou de tryptophane) Réactifs
pour l'épreuve de l'indole (disponibles
dans le commerce)
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ouillon de glucose tamponné Réactifs pour
l'épreuve de Voges-Proskauer (disponibles dans
le commerce) Solution de rouge de méthyle
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Gélose au citrate de Simmon (SC)
B. Trousses ou systèmes d'identification rapide
(tels que API, Vitek ou l'équivalent)
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