Méthode de laboratoire
MFLP-23
mars 2006
(Version PDF)

DÉTECTION SPÉCIFIQUE DES SOUCHES DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS À L'AIDE D'UNE RÉACTION EN CHAÎNE DE LA POLYMÉRASE (PCR) MULTIPLEX BASÉE SUR LE MARQUEUR TAXONOMIQUE R72H ET LES GÈNES DE L'HÉMOLYSINE TDH ET TRH

Margaret Green
ACIA - Laboratoire de Sidney - Maladies virales et viroïdes des plantes
8801 East Saanich Road
Sidney (C.-B.) V8L 1H3
Courriel : greenmg@inspection.gc.ca

Enrico Buenaventura, Christina Wong et Jennifer Liu
ACIA - Laboratoire de Burnaby (Boundary)
2250 Boundary Road
Burnaby (C.-B.) V5M 4L9
Courriel : buenaventura@inspection.gc.ca

1. APPLICATION

La présente méthode s'applique à l'identification rapide des souches de Vibrio parahaemolyticus (Vp) présentes dans les aliments et l'eau de mer, ainsi que dans les échantillons environnementaux et cliniques à l'aide de la méthode MFLP-37 (8.2) de Santé Canada et d'autres méthodes équivalentes.

La méthode peut être appliquée à la caractérisation et à l'identification des colonies présumées positives isolées sur géloses sélectives ou différentielles utilisées couramment pour l'isolement de ce pathogène. Lorsqu'elle est appliquée à titre de méthode d'identification dans le cadre de méthodes quantitatives comme celle du nombre le plus probable (NPP), la méthode permet d'obtenir des résultats quantitatifs pour les souches de Vp (8.3).

2. DESCRIPTION

Cette technique de réaction en chaîne de la polymérase (PCR) s'est révélée très spécifique et très sensible pour l'identification de Vibrio parahaemolyticus isolé de divers produits alimentaires et échantillons environnementaux, ainsi que d'échantillons cliniques (Buenaventura, résultats non publiés).

3. PRINCIPE

Après pré-enrichissement, des colonies présumées positives détectées par culture sur des géloses sélectives sont soumises à la PCR qui amplifie trois séquences d'ADN spécifiques - le fragment r72h du génome du Vp (identifiant l'espèce), le gène tdh (hémolysine directe thermostable) et le gène trh (hémolysine trh). Les amorces oligonucléotidiques utilisées dans la PCR sont très spécifiques à Vibrio parahaemolyticus et n'amplifient pas l'ADN présent dans d'autres espèces de Vibrio ou d'autres organismes dans les conditions de réaction décrites. Les fragments d'ADN amplifiés par la PCR obtenus ont des tailles moléculaires déterminées, définies par les amorces, et sont facilement identifiés par électrophorèse sur gel d'agarose. L'ensemble de la procédure permet d'identifier les colonies présumées positives en moins de 4 heures et, dans la plupart des cas, peut remplacer la batterie habituelle d'essais biochimiques utilisés dans les étapes de confirmation en aval, ce qui permet de réaliser des économies considérables en matière de temps, de travail et de coût d'analyse.

La réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est une procédure visée par des brevets américains appartenant à Hoffman-LaRoche.

4. DÉFINITION DES TERMES

Voir l'annexe A du volume 2.

5. PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS

Voir l'annexe B du volume 2.

6. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENT SPÉCIAL

1. Thermocycleur (Stratagene Robocycler ou Applied Biosystems GeneAmp 9700), ou l'équivalent
   
   
2. Four à micro-ondes ou plaque chauffante
   
   
3. Nécessaire d'électrophorèse pour gels submergés, avec peignes appropriés et bloc d'alimentation, ou l'équivalent
   
   
4. Transilluminateur UV à ondes courtes pour visualiser l'ADN coloré dans les gels d'agarose
   
   
5. Système de photo-documentation ou système d'imagerie numérique équivalent
   
   
6. Micropipettes réglables : 0,5 - 10 µL, 10 - 100 µL, 20 - 200 µL et 200 - 1000 µL
   
   
7. Embouts de pipette pour les micropipettes ci-dessus (munis obligatoirement de filtres contre les aérosols)
   
   
8. Bloc chauffant à agitation convenant aux microtubes à centrifuger de 1,5 mL (VWR Thermomixer), ou l'équivalent
   
   
9. Mélangeur Vortex
   
   
10. Microtubes à centrifuger - capacité de 1,5 mL, ou l'équivalent
    
    
11. Tubes en bande à paroi mince pour PCR, avec bouchons et/ou tubes individuels avec bouchons - 0,2 mL (200 µL), ou l'équivalent
    
    
12. Microcentrifugeuse
    
    
13. Centrifugeuse Strip-fuge pour centrifuger les tubes à PCR
    
    
14. Marqueur de poids moléculaire d'ADN (échelle d'ADN de 50 pb recommandée)
    
    
15. De plus, les produits chimiques et réactifs suivants sont nécessaires. Voir la section 9 qui contient la liste des tampons et réactifs et leurs formules :
    
    
    1. Agarose
    2. Eau stérile ultrapure, apyrogène, exempte de nucléase, ou l'équivalent
    3. Acide orthophosphorique (85 %, 1,679 g/mL
    4. Orange G ou tampon de chargement équivalent
    5. Glycérol
    6. dATP, dCTP, dGTP et dTTP 100 mM
    7. Bromure d'éthidium (10 mg/mL)
    8. EDTA
    9. ADN polymérase Taq (5 unités/µL)
    10. MgCl₂ 50 mM
    11. Tampon PCR 10X, sans MgCl₂
    12. Tris[hydroxyméthyl]aminométhane
    13. Chlorhydrate de Tris
    14. Alimentation en eau désionisée pour l'électrophorèse
        
        
16. Témoins de culture
    
    
    1. Témoin positif : Vibrio parahaemolyticus (utiliser une souche de Vibrio parahaemolyticus bien caractérisée, comme ATCC 49529)
    2. Témoins négatifs : Autres que Vp

7. MÉTHODE

Les unités d'échantillonnage sont traitées et soumises aux techniques d'enrichissement, d'isolement et de culture décrites dans la méthode MFLP-37 (8.2) ou toute autre méthode équivalente. Lorsque des colonies présumées positives sont observées sur les milieux de culture, prélever le nombre de colonies indiquées dans la méthode et soumettre chaque colonie à la PCR multiplex, laquelle est exécutée comme suit :

7.1 Manipulation des échantillons

Les colonies présumées positives (V. parahaemolyticus) isolées sur les géloses sélectives/différentielles (p. ex. TCBS) sont prélevées individuellement et soumises à la PCR multiplex comme il est indiqué ci-après. Un témoin positif constitué d'une colonie d'une souche de V. parahaemolyticus de laboratoire est également analysé avec chaque échantillon. On ajoute également un témoin négatif (autre que Vp) et un témoin sans matrice ou constitué d'eau.

7.2 Lyse des cellules

7.3 Méthode de la PCR

Les amorces utilisées pour la PCR multiplex sont basées sur des séquences nucléotidiques publiées et visent trois séquences différentes du génome de Vibrio parahaemolyticus. Les amorces de PCR peuvent provenir du commerce (sous forme d'oligonucléotides dessalés) et n'ont pas besoin d'être purifiées par HPLC pour la présente méthode.

7.4 Programme des cycles de température

7.5 Électrophorèse sur gel d'agarose

7.6 Interprétation des résultats

Les amplicons (produits de la PCR) générés par cette méthode PCR multiplex à partir des séquences d'ADN trh, r72h et tdh de V. parahaemolyticus sont des fragments d'ADN double brin de 486, de 387 ou 320 et de 270 pb, respectivement. Par conséquent, un essai PCR positif donnera des fragments d'ADN qui apparaîtront sous forme de bandes intenses sur le gel d'agarose coloré à l'EtBr. On peut déterminer la taille moléculaire des bandes en comparant leur migration à celle d'un marqueur de tailles moléculaires d'ADN chargé sur le même gel.

Le tableau ci-après indique les résultats attendus et leur interprétation dans le cas de la PCR multiplex. Lorsque les résultats ne concordent pas avec le tableau, il faut répéter la PCR multiplex et confirmer par des essais biochimiques, comme il est indiqué dans la méthode MFLP-37 (8.2) ou une méthode équivalente.

**Lorsque les résultats ne concordent pas avec ce tableau, répéter la PCR multiplex et confirmer par des essais biochimiques.

Un échantillon de PCR négatif ne produit généralement pas de bandes visibles sur un gel d'agarose coloré à l'EtBr. Dans les cas extrêmement rares où un échantillon donne des bandes ne correspondant pas aux amplicons de 486, de 387 ou 320 ou de 270 pb (produits d'amplification non spécifiques), cet échantillon est considéré comme négatif. Toute bande correspondant aux amplicons de 486, de 387 ou 320 ou de 270 pb apparaissant dans le témoin négatif (section 7.2.1) indique des problèmes éventuels de contamination. Les réactifs sont considérés comme une source possible de contamination et doivent être jetés. Il faut analyser de nouveau les échantillons avec de nouveaux réactifs. Examiner aussi toutes les possibilités de contamination par des aérosols.

7.7 Confirmation biochimique (facultative)

Des galeries API 20E ou des trousses d'identification rapide équivalentes peuvent être utilisées comme solution de rechange aux milieux en tube traditionnels pour les essais biochimiques. Toutefois, certains Vibrio spp. ne croîtront pas dans les milieux des galeries d'essais commerciales lorsque'une solution physiologique saline (NaCl 0,85 %) est utilisée comme diluant. Utiliser du NaCl 2 % comme diluant. Si les galeries commerciales ne permettent pas l'identification, poursuivre la confirmation à l'aide d'essais traditionnels en utilisant une méthode de la DGPSA (8.2) ou une méthode équivalente.

8. RÉFÉRENCES

9. RÉACTIFS

Les tampons, l'eau désionisée, les pipettes, les embouts de pipette et tout le matériel utilisé dans la préparation des échantillons, la préparation de la PCR et les manipulations succédant à la PCR (sauf l'électrophorèse sur gel d'agarose) qui entrent en contact avec les échantillons ou les réactifs de la PCR doivent être autoclavés avant usage afin d'éliminer les ADNases et les autres contaminants. Dans le but d'éviter tout problème de contamination, il est préférable de préparer tous les réactifs dans une aire de travail réservée à cette fin.

9.1 PCR Master Mix

Les mélanges PCR Master Mix (sans l'ADN polymérase taq) peuvent être préparés bien en avance et entreposés à -20 °C jusqu'à l'utilisation (stables pendant un an); l'ADN polymérase taq peut être ajoutée immédiatement avant l'usage. Toutes les solutions mères doivent être également entreposées à -20 °C jusqu'à l'utilisation. Une fois dégelés, les réactifs de la PCR (sauf l'ADN polymérase taq) sont conservés à 4 °C. La stabilité à long terme des réactifs de la PCR au réfrigérateur est inconnue. Les laboratoires devraient diviser les réactifs en plus petits volumes de travail afin de réduire les temps d'entreposage au réfrigérateur.

Voici comment préparer la quantité exacte de PCR Master Mix requise pour une seule réaction de PCR (23 µL de Master Mix + 2 µL de matrice). En pratique, il peut être plus utile de préparer des lots de PCR Master Mix. Dans le calcul des volumes pour la préparation de lots, multiplier le volume par tube de réaction par le nombre d'échantillons à analyser (y compris les témoins) et par 1,1 (un facteur permettant à l'analyste de disposer d'un léger excès de Master Mix au cas où une réaction devrait être jetée ou répétée).

9.2 Tampon PCR 10X

Tris-HCl 200 mM (pH 8,4)
KCl 500 mM
Le tampon PCR est fourni sous forme de concentré 10X qui doit être dilué avant usage.

9.3 Tampon TPE 10X, tampon TBE 10X ou tampon TAE 10X

Le tampon TPE (Tris-Phosphate-EDTA) concentré 10X est préparé comme suit :

Ajouter la quantité d'eau désionisée nécessaire pour obtenir un volume final de 1 litre.

Entreposer à la température ambiante. Au moment d'utiliser, diluer 1:10 avec de l'eau désionisée pour l'électrophorèse sur gel d'agarose.

Les tampons TBE (Tris-Borate-EDTA) concentré 10X et TAE (Tris-Acétate-EDTA) concentré 10X sont disponibles dans le commerce. Au moment d'utiliser, diluer 1:10 avec de l'eau désionisée pour l'électrophorèse sur gel d'agarose.

9.4 Orange G 10X

Stériliser et répartir en aliquotes de 1 mL dans des microtubes à centrifuger de 1,5 mL. Entreposer à long terme à -20 °C; les aliquotes dégelées doivent être entreposées à 4 °C.

9.5 Échelle de 50 pb (marqueur de poids moléculaires d'ADN)