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Procédure de laboratoire MFLP-20
Septembre 2004
(Version PDF)
DIRECTION GÉNÉRALE DES PRODUITS DE
SANTÉ ET DES ALIMENTS
OTTAWA
L'ESSAI GENEQUENCE ® PAR MICROPUITS DE SALMONELLA POUR
LA
DÉTECTION DES SALMONELLES DANS UNE VARIÉTÉ D'ALIMENTS
Don Warburton et Premalatha Himawan
Division de l'évaluation
Bureau des dangers microbiens, Direction des aliments
Localisateur postal : 2204A1
DGPSA, Ottawa (Ontario) K1A 0L2
Don_Warburton@hc-sc.gc.ca
1. APPLICATION
Cette méthode est applicable à la détection
de Salmonella spp. dans une grande variété d'aliments
dont la viande, la volaille, le poisson et les fruits de mer,
les fruits et les légumes, les oeufs, les noix, les farines,
les produits de confiserie, les produits laitiers, les épices,
les aliments pour animaux et divers aliments transformés.
2. DESCRIPTION
L'essai par micropuits de Salmonella GENEQUENCE® est un
outil diagnostique par sonde d'ADN sous forme de trousse qui
permet une détection rapide et précise de Salmonella spp. dans les aliments. Les résultats sont obtenus en
48 heures approximativement. Le test démontre une sensibilité équivalant à celle
des procédures de culture de référence
et peut détecter la présence d'une quantité aussi
faible qu'une cellule de Salmonella dans un échantillon
d'aliment de 25 g lorsque les protocoles d'enrichissement spécifiés
sont utilisés. La méthode GENEQUENCE est conçue
pour être utilisée par un personnel de laboratoire
qualifié qui suit des pratiques microbiologiques normalisées.
3. PRINCIPE
Pour effectuer un essai GENEQUENCE par hybridation de l'ADN,
on emploie des sondes d'ADN spécifiques aux salmonelles
marquées à la peroxydase de raifort ainsi qu'un
point de virage colorimétrique pour détecter la
présence de Salmonella spp. dans des échantillons
d'aliments à la suite de l'enrichissement dans un milieu
de culture. Après le pré-enrichissement de l'échantillon,
l'enrichissement sélectif et les périodes d'incubation
suivant l'enrichissement, les bactéries ciblées
sont lysées par un enzyme à 65 °C et les
sondes d'oligonucléotides spécifiques aux
salmonelles sont ajoutées pour une incubation par hybridation
de 60 minutes à 45 °C. Si l'ARN ribosomique (ARNr)
de Salmonella est présent dans l'échantillon d'essai,
une sonde de détection marquée directement à la
peroxydase de raifort (HRP) et une sonde de capture avec séquence
d'acide polydéoxyadénylique (poly dA) hybrident
des séquences d'ARNr de l'organisme cible. Simultanément,
l'appariement des bases entre la sonde de capture avec séquence
de poly dA et les micropuits de polystyrène enrobés
d'acide polydéoxythymidylique (poly dT) facilite une
capture en phase solide des molécules hybrides ciblées
par la sonde. Une sonde non liée est éliminée
par lavage et un substrat chromogène est ajouté à chaque
puits. La réaction du HRP avec le substrat chromogène
produit une couleur bleue. La réaction est arrêtée
par l'ajout d'acide sulfurique, qui change la couleur
du substrat de bleue à jaune. Un lecteur de plaque à micropuits
ou de bandelette de micropuits (A 450) mesure l'absorbance;
l'absorbance excédant la valeur de seuil indique la présence
de Salmonella spp. dans l'échantillon d'essai.
Les résultats d'analyse positifs doivent être confirmés
par les méthodes de culture normalisées.
4. DÉFINITIONS DES TERMES
Voir l'annexe A du volume 3.
5. PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS
Voir l'annexe B du volume 3.
6. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENTS SPÉCIAUX
| Note : Le superviseur de laboratoire doit s'assurer que
l'analyse décrite dans la présente méthode
est réalisée selon la norme internationale « ISO/IEC
17025:1999 (ou une version ultérieure) : Prescriptions
générales concernant la compétence
des laboratoires d'étalonnages et d'essais. » |
Les milieux énumérés
ci-dessous sont disponibles dans le commerce et doivent être
préparés et stérilisés selon les
instructions du fabricant. Voir aussi l'annexe G du volume 3
pour la formulation de chaque milieu.
| Note : Si l'analyste utilise des variantes des milieux énumérés
ci-après (un produit offert commercialement ou préparé à partir
d'ingrédients), il incombe à l'analyste ou
au superviseur de laboratoire d'en assurer l'équivalence. |
1) Fournis avec
la trousse - (no 6700;
permettent d'effectuer 96 tests - Neogen Corporation, téléphone
: (517) 372-9200, télécopieur : (517) 372-0108,
Internet :
 www.neogen.com)
(connu antérieurement sous
le nom Gene-Trak)
1 microplaque, 96 puits enduits, en bandelettes divisibles
2 flacons Réactif de lyse concentré (Réactif 1A)
1 bouteille Tampon de réactif de lyse (Réactif 1B), 12 ml
1 bouteille Solution d'hybridation (Solution 2), 18 ml
1 bouteille Solution pour sonde à Salmonella (Solution 3), 6 ml
1 bouteille Solution de lavage concentrée 20X (Solution 4), 50 ml
1 bouteille Solution de substrat chromogène (Solution 5), 15 ml
1 bouteille Solution d'arrêt de réaction (Solution 6), 5 ml
1 bouteille Contrôle positif (5 ml)
1 bouteille Contrôle négatif (5 ml)
1 charte de mélange hybridation/sonde
1 feuillet d'information
Entreposer la microplaque, le contrôle positif, le contrôle
négatif et les réactifs 1A, 2, 3 et 5 à 2 à 8 °C.
Les autres réactifs peuvent être entreposés à 2 à 25 °C.
Toute la trousse peut être entreposée à 2 à 8 °C.
Une fois que le réactif 1A est reconstitué, il doit être
entreposé à -20 °C et est stable pendant 60 jours sous cette
forme.
Mise en garde : La solution d'arrêt contient de l'acide
sulfurique 4,0 N. La solution d'hybridation contient du formamide. Éviter
tout contact avec la peau et les muqueuses. Consulter la fiche
signalétique pour plus de renseignements.
2) Bouillons d'enrichissement - varient selon le type
d'aliment (voir la méthode MFHPB-20)
Bouillon lactosé (ou
autre milieu de pré-enrichissement tel qu'approprié pour
le type d'échantillon)
Bouillon de tétrathionate additionné de vert brillant
Bouillon Rappaport-Vassiliadis
Bouillon Gram négatif
3) Matériel
Équipement
Mélangeur ou homogénéisateur
Incubateur à 35 °C
Incubateur ou bain-marie à 42 °C
Bain-marie ou bloc de chauffage à 65 °C
Petit agitateur rotatif à plate-forme pouvant aller à 150 tr/min
(facultatif)
Bloc de chauffage (avec couvercle) ou incubateur à air à 45 °C
Source de vide
Appareil de lavage pour microplaque avec 8 puits par orientation de bandelette
Micro pipette pour distribuer un volume de 150 μl
Micropipette ou pipette à répétition pour distribuer un
volume de 100 μl
Pipette à 8 canaux (recommandé) ou pipette à répétition
pour distribuer des volumes de 50 μl, de 125 μl et de 150 μl
Lecteur de microplaque ou de bandelettes à 450 nm avec discrimination
d'au moins 0,01 unité d'absorbance
Cylindre gradué de 500 ml ou de 1 L
Support à éprouvettes
Minuterie
| Note : Il incombe à chaque laboratoire de s'assurer
que la température des incubateurs ou des bains-marie
est maintenue aux températures recommandées.
Quand une température de 35 °C est recommandée
dans la procédure, l'incubateur peut être à 35 ± 1,0 °C.
De façon similaire, des températures inférieures
de 30 ou 25 °C peuvent être de ± 1,0 °C.
Cependant, quand des températures supérieures
sont recommandées, telles que 43 ou 45,5 °C,
il est impératif que les incubateurs ou les bains-marie
soient maintenus à ± 0,5 °C parce que
des températures plus élevées peuvent être
létales pour le micro-organisme qu'on cherche à isoler. |
Fournitures
Bouteilles de culture pour le pré-enrichissement des échantillons
Tubes à culture pour des volumes d'échantillon de 11 ml
Éprouvettes, en verre, 12 x 75 mm
Embouts de pipette
Papier absorbant
Pipettes de 10 ml ou de 25 ml
7. MARCHE À SUIVRE
7.1 Manipulation des unités d'échantillonnage
7.1.1 Analyser les unités d'échantillonnage
le plus rapidement possible, de préférence dans
les 24 h suivant la réception. Pendant le transport, à l'exception
des produits stables à la température de la pièce,
garder les unités d'échantillonnage réfrigérées
(0 à 5 °C) ou congelées, selon la nature
du produit. Dégeler les échantillons congelés
dans un réfrigérateur ou dans des conditions de
temps et de température qui empêchent la prolifération
ou la mort microbienne. Les aliments qui sont partiellement
dégelés devraient être entreposés
dans un réfrigérateur.
| Note : Utiliser des contenants appropriés pour
s'assurer que les égouttements du produit ne contaminent
pas l'environnement du laboratoire. |
7.1.2 Si l'unité d'échantillonnage
reçue pour analyse est inférieure à l'unité analytique
recommandée, analyser toute la quantité et enregistrer
le poids utilisé. Ajuster le volume du bouillon d'enrichissement
pour maintenir une dilution de 1 pour 10 de l'échantillon.
7.1.3 Utiliser des techniques aseptiques et de l'équipement stérile à toutes
les étapes de l'analyse. Le confinement pendant la manipulation de produits
en poudre est crucial si on veut éviter une contamination croisée
de l'environnement de travail.
7.2 Préparation de l'analyse
7.2.1 Avoir à sa disposition du bouillon d'enrichissement,
d'autres milieux et des fournitures stériles.
7.2.2 Nettoyer la surface de travail à l'aide
d'un désinfectant approprié.
7.3 Préparation des échantillons
Chaque unité d'échantillonnage peut être
analysée individuellement ou les unités analytiques
peuvent être combinées. Effectuer le test conformément
aux instructions suivantes :
7.3.1 Afin d'assurer que l'unité analytique est vraiment
représentative, agiter les liquides ou les substances fluides jusqu'à ce
qu'elles soient homogènes. Si l'unité d'échantillonnage
est un solide, constituer l'unité analytique en prélevant
des portions à plusieurs endroits. Afin de réduire la charge
de travail, les unités analytiques peuvent être regroupées
pour l'analyse. Il est recommandé que l'échantillon
composite ne contienne pas plus de cinq unités analytiques.
7.4 Pré-enrichissement et enrichissement
7.4.1 Peser de façon aseptique 25 g ou ml (l'unité analytique)
dans un sac à stomacher avec filtre et ajouter 225 ml
de Bouillon nutritif. Voir la méthode MFHPB-20 (Volume
2) pour l'utilisation d'autres bouillons d'enrichissement. Incuber
pendant 22 ± 2 heures à 35 °C.
| NOTE : Tout milieu d'enrichissement doit être préchauffé à la
température ambiante avant l'inoculation. |
7.4.2 Retirer la culture pré-enrichie
de l'incubation et bien mélanger. Transférer 1
ml de culture pré-enrichie à 10 ml de bouillon
de tétrathionate (TBG). Transférer 0,1 ml de culture
pré-enrichie à 10 ml de bouillon Rappaport-Vassiliadis
(RV). Incuber la culture TBG pendant 18 à 24 heures à 35 ̊C
et la culture RV pendant 18 à 24 heures à 42 °C.
7.4.3 Retirer les cultures TBG et RV de l'incubation et bien
mélanger. Transférer 1 ml de la culture TBG à 10
ml de bouillon Gram négatif (GN). Transférer 1
ml de la culture RV à un second 10 ml de GN. Incuber
les cultures GN pendant 6 heures à 35 °C. Garder
les cultures TBG et RV au réfrigérateur pour une
confirmation possible.
| NOTE : Les bouillons GN peuvent être réfrigérés
pendant la nuit ou jusqu'à 48 heures avant l'essai
GENEQUENCE. |
7.4.3 Effectuer l'essai GENEQUENCE en
utilisant un échantillon combiné contenant 0,2
ml de chaque culture GN. Garder les cultures GN au réfrigérateur
pour une confirmation possible.
7.5 Méthode d'analyse
| NOTE : Tous les transferts à la pipette doivent être
effectués en utilisant soit une pipette jetable et
une poire à pipette ou une micropipette avec embouts
jetables. Ne pas pipetter à la bouche. Cet essai
doit être effectué dans des conditions normales
d'essais en laboratoire quant à l'humidité, à l'éclairage,
etc. Les étapes nécessitant une incubation à la
température ambiante doivent être effectuées
entre 18 et 30°C. Les réactifs de la trousse
qui ont été réfrigérés
doivent être équilibrés à la
température ambiante avant utilisation, mais ne doivent
pas être laissés non réfrigérés
pendant de longues périodes. |
7.5.1 Avant de commencer l'essai :
7.5.1.1 Allumer le bain-marie ou le bloc chauffant et en ajuster
la température à 65 °C. Le bain-marie doit être
rempli à un niveau d'environ 3,8 cm (1,5 pouce). Les
puits du bloc de chauffage doivent être remplis environ
au tiers avec de l'eau déionisée.
7.5.1.2 À la bouteille de réactif 1A (réactif
de lyse concentré), ajouter 6 ml de la solution 1B (tampon
de réactif de lyse). Dissoudre le contenu en remuant
doucement et placer la bouteille sur de la glace.
| NOTE : Le réactif de lyse est stable sous forme
reconstituée pendant 60 jours lorsque entreposé à -20 ̊C.
Pour décongeler, placer la bouteille à la
température ambiante. Lorsque décongelée,
placer sur de la glace (une congélation-décongélation
n'affecte pas de manière défavorable le réactif
reconstitué). |
7.5.1.3 Pour chaque échantillon à analyser, étiqueter une éprouvette
en verre de 12 x 75 mm avec l'identification d'échantillon
appropriée et la placer dans un support. Inclure des tubes pour 1 contrôle
positif et 1 contrôle négatif par série d'essai expérimental.
7.5.1.4 Préparer la solution de lavage 1X. Diluer la
solution 4 (solution de lavage concentrée 20X) en mélangeant
le contenu d'une bouteille (50 ml) avec 950 ml d'eau distillée
ou déionisée. Remplir le réservoir à tampon
de l'appareil de lavage de plaques (voir les instructions du
fabricant pour le réglage et l'utilisation).
| NOTE : La solution de lavage 1X peut être entreposée
jusqu'à 60 jours dans une bouteille fermée à la
température ambiante. |
7.5.1.5 Préparer un mélange
des solutions 2 et 3 dans un contenant de plastique ou de verre
de grosseur appropriée dans une proportion de 4 pour
1 afin d'obtenir une quantité suffisante pour le
nombre d'échantillons à analyser. Utiliser la
formule ci-dessous ou voir la charte de mélange incluse
dans la trousse d'essais.
Volume de la solution 2 = [(N x 0,1) + 1,6] ml
Volume de la solution 3 = [(N x 0,025) + 0,4] ml
où N représente le nombre d'échantillons à analyser,
y compris les contrôles
| NOTE : La formule ci-dessus prévoit un excédent
de volume de 2,0 ml; un excédent de volume différent
peut être approprié selon le type de contenant
utilisé pour préparer le mélange. |
7.5.1.6 Placer le nombre approprié de
micropuits enduits dans le cadre de la plaque, en remplissant
le cadre de gauche à droite et de l'avant à l'arrière
en rangées de 8. Inclure des puits pour le blanc de réactif,
le contrôle négatif et le contrôle positif. Éviter
de toucher le fond des puits. Si la dernière rangée
compte moins de 8 puits, remplir la rangée comme nécessaire
(des puits colorés spéciaux sont disponibles chez
Neogen Corp. dans ce but).
7.5.2. Procédure d'essai
7.5.2.1 Mélanger les cultures d'échantillons
(cultures GN). Ajouter 0,2 ml de chacune des deux cultures GN
pour chaque échantillon aux tubes appropriés (0,2
ml de chacune des deux cultures GN pour chaque échantillon
combiné dans un tube). Agiter les solutions de contrôle
positif et de contrôle négatif et ajouter 0,4 ml
de chaque contrôle aux tubes appropriés.
7.5.2.2 Ajouter 0,1 mL de la solution 1 (réactif de
lyse reconstitué) à chaque tube. Agiter manuellement
le support à tubes pendant 5 secondes. La solution résultante
doit être de couleur bleue. Si l'un des tubes n'est
pas bleu, vérifier pour l'ajout approprié du réactif.
Incuber les tubes dans le bain-marie ou le bloc de chauffage à 65 °C
pendant 5 minutes.
7.5.2.3 Retirer les tubes du bain-marie ou du bloc de chauffage à 65 °C.
Transférer 0,150 ml de chaque échantillon lysé,
y compris les contrôles, dans le micropuits désigné.
Le premier puits doit être réservé pour
le blanc de réactif et ne doit pas recevoir d'échantillon.
Le deuxième puits doit être utilisé pour
le contrôle négatif et le troisième, pour
le contrôle positif.
7.5.2.4 Mélanger vigoureusement les solutions 2 et 3
(solution hybridation/sonde) préparées à l'étape
7.5.1.5 ci-dessus. Ajouter 0,125 ml à chaque puits sauf
au puits du blanc de réactif. Dans le cas où une
pipette multi-canaux est utilisée, mélanger le
contenu des puits en aspirant et retournant le contenu dans
les puits au moins 5 fois. Sinon, agiter la plaque sur un agitateur
rotatif à la température ambiante pendant 2 minutes à 150
tr/min.
7.5.2.5 Incuber la plaque dans un bloc de chauffage recouvert
ou un incubateur à air à 45 °C pendant 60
minutes.
7.5.2.6 Laver les puits 5 fois à la température
ambiante en utilisant un appareil de lavage de bandelettes de
micropuits. Pour chaque cycle de lavage, traiter une bandelette
de 8 puits à la fois, en aspirant le liquide, en remplissant
les puits et en passant ensuite à la bandelette suivante.
Après le dernier lavage, aspirer le liquide des puits,
enlever ensuite le liquide résiduel en inversant la plaque
et en la secouant sur un papier absorbant. Tenir la plaque en
pressant doucement les côtés du cadre pour garder
les bandelettes en place.
7.5.2.7 Ajouter 0,15 ml de la solution 5 (solution de substrat
chromogène) à chaque puits, y compris le puits
du blanc de réactif. Incuber la plaque à la température
ambiante pendant 20 minutes.
7.5.2.8 Ajouter 0,5 ml de la solution 6 (solution d'arrêt) à chaque
puits, y compris le puits de blanc de réactif. Taper
doucement le côté du cadre de la plaque à quelques
reprises pour s'assurer que le tout est bien mélangé.
7.5.2.9 Lire l'absorbance à 450 nm en utilisant un
lecteur de plaque ou de bandelette conformément aux instructions
du fabricant. Faire le blanc en utilisant le premier puits contenant
le substrat chromogène et la solution d'arrêt (ne
pas faire le blanc avec de l'air).
7.6 Interprétation des résultats
7.6.1 Valeurs des contrôles
La valeur d'absorbance pour le contrôle négatif
doit être < 0,15. Sinon, l'essai est erroné et
doit être répété.
La valeur d'absorbance pour le contrôle positif doit être > 1,00.
Sinon, l'essai est erroné et doit être répété.
7.6.2 Critère négatif
Les analyses produisant une valeur d'absorbance < 0,10 indiquent
l'absence de Salmonella spp. dans l'échantillon d'essai.
7.6.3 Critère positif
Les analyses produisant une valeur d'absorbance de > 0,10
indiquent la présence de Salmonella spp. dans l'échantillon
d'essai. Ces échantillons doivent être confirmés
par des procédures de cultures normalisées.
7.7 Confirmation des résultats positifs
Les échantillons positifs doivent être confirmés
par des cultures de la façon décrite dans la méthode
MFHPB-20. Ensemencer des plaques des géloses sélectives
spécifiées et confirmer à l'aide de
procédures biochimiques et sérologiques.
7.8 Limitations
Les sondes d'ADN utilisées dans cette trousse ne réagissent
pas avec les sérotypes de l'espèce Salmonella
bongori.
8. RÉFÉRENCES
8.1 D'Aoust et Purvis. 1998. Isolement et identification de
Salmonella dans les aliments. Volume 2. Compendium de méthodes.
Santé Canada. http://www.hc-sc.gc.ca/food-aliment/mh-dm/mhe-dme/
compendium/volume_2/f_mfhpb2001.html
8.2 Comité technique 34. Microbiologie des aliments
et moulée animale-- Méthode horizontale pour
la recherche de Salmonella spp. Organisation internationale de normalisation.
(ISO 6579:2002, 4e édition). Organisation internationale
des normes : Genève. Ce document est disponible à l'adresse
suivante : http://www.iso.ch/iso/fr/CatalogueDetailPage.CatalogueDetail?
CSNUMBER=29315&ICS1=7&ICS 2=100&ICS3=30
8.3 US Department of Agriculture, Food Safety and Inspection
Service, Office of Public Health and Science. Microbiology Laboratory
Guidebook [Internet]. Washington : The Dept; c1998 [rev 2001
January 10; cited 2003 June]. Chapitre 4, Isolation and Identification
of Salmonella from Meat, Poultry, and Egg Products [environ 14 écrans].
Ce document est disponible à l'adresse suivante : http://www.fsis.usda.gov/OPHS/microlab/mlgchp4.pdf
8.4 US Food & Drug Administration, Center for Food Safety & Applied
Nutrition.
Bacteriological Analytical Manual Online [Internet]. Washington : The Admin;
c1998 [rev 2001 October; cited 2003 June]. Chapitre 5, Salmonella [environ
12 écrans]. Ce document est disponible à l'adresse suivante :
http://vm.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-5.html
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