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Procédure de laboratoire
MFLP-27
Septembre 2003
(Version PDF)
DIRECTION GÉNÉRALE DES PRODUITS DE SANTÉ ET
DES ALIMENTS
OTTAWA
LA MÉTHODE DU SYSTÈME QUALICON BAX® POUR LA
DÉTECTION D'ENTEROBACTER SAKAZAKII DANS DES ALIMENTS
SÉLECTIONNÉS
1. APPLICATION
Cette méthode est applicable à la détection
d'Enterobacter sakazakii, après
enrichissement, dans des aliments sélectionnés
comprenant les formules pour nourrissons en poudre, les
ingrédients laitiers et de soja en poudre et les
échantillons environnementaux de production alimentaire.
2. DESCRIPTION
Le système BAX® est un instrument pratique de
dépistage oui/non qui utilise la technologie de la
réaction en chaîne de la polymérase (PCR) pour
l'amplification rapide et la détection par
fluorescence. Les transformateurs d'aliments et les
laboratoires associés peuvent utiliser le système
BAX® comme méthode rapide permettant de
détecter avec précision la présence
d'Enterobacter sakazakii dans une grande
variété d'aliments. Après un
préenrichissement de 20 à 22 heures et un
enrichissement secondaire de trois heures, la
préparation des échantillons requiert environ une
heure du temps de l'utilisateur, et la procédure
automatisée donne des résultats fiables dans un
délai d'environ quatre heures. Les études de
validation du système BAX® utilisaient une
méthode d'enrichissement développée par le
Nestle Research Centre. Le système BAX® est
conçu pour être utilisé par un personnel de
laboratoire qualifié qui suit les procédures
normalisées de microbiologie.
3. PRINCIPE
Le système BAX® utilise la technologie de la
réaction en chaîne de la polymérase (PCR) pour
amplifier un fragment précis de l'ADN
bactérien, qui est stable et non affecté par
l'environnement de croissance. Ce fragment est une
séquence génétique unique
d'Enterobacter sakazakii, c'est pourquoi la
méthode constitue un indicateur très fiable de la
présence de cet organisme. Le système BAX®
automatisé utilise ensuite la détection par
fluorescence pour analyser le produit de la PCR et
déterminer si les résultats sont positifs ou
négatifs.
Le PCR représente un moyen puissant d'offrir
rapidement des millions de copies d'un fragment
précis d'ADN. Dans une application typique, on
combine l'échantillon d'ADN à une
polymérase, des nucléotides et des amorces
spécifiques à une séquence donnée de
nucléotides. Ce mélange est alors soumis à une
série de cycles chronométrés de chauffage et
de refroidissement. Le chauffage dénature ou sépare
l'ADN en brins distincts. À mesure que le
mélange refroidit, les amorces reconnaissent la
séquence cible d'ADN et s'y fixent par annelage.
L'ADN polymérase utilise ensuite les
nucléotides pour étendre les amorces, ce qui a pour
effet de créer deux copies du fragment d'ADN cible.
Des cycles répétés de dénaturation,
d'hybridation et d'élongation produisent des
augmentations exponentielles du nombre de fragments d'ADN
cibles en quelques heures à peine. Si la séquence
cible n'est pas présente, il ne se produit aucune
amplification détectable.
Le système BAX® simplifie ce processus en combinant
les amorces, la polymérase, les nucléotides et le
témoin positif dans une seule tablette
d'échantillon déjà emballée dans des
tubes PCR. De plus, la détection automatisée par
fluorescence permet les tests en tubes fermés,
éliminant virtuellement la possibilité de
contamination entraînée avec l'ADN
amplifié.
4. DÉFINITIONS DES TERMES
Voir l'annexe A du volume 3.
5. PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS
Voir l'annexe B du volume 3.
6. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENTS SPÉCIAUX
1) Fournis avec la trousse - (no 17720657;
permettent d'effectuer 96 tests; DuPont Qualicon,
téléphone : 1 800 863-6842, télécopieur :
302 695-5301)
2 sachets - Tablettes d'échantillon PCR,
emballées 1 tablette par tube PCR dans 12 bandelettes
de 8 tubes. Les tablettes comprennent les réactifs
nécessaires à la réaction du test, ainsi
qu'un témoin positif interne (ce qui évite
d'avoir à exécuter une réaction CQ
distincte). Les tablettes pèsent 7,6 ± 0,1 mg.
1 sachet - Bouchons optiques, 12 bandelettes de 8
bouchons.
2 bouteilles - Tampon de lyse, pH de 8,35 ± 0,05
à 25oC, bouteille de 12 ml. Utiliser pour
préparer le réactif de lyse.
1 flacon - Solution de protéase, flacon de 400
µL. Utiliser pour préparer le réactif de
lyse.
2) Bouillons d'enrichissement et milieu de
confirmation
- Enrichissement primaire - bouillon mLST avec
vancomycine*
Mélanger 20 g de tryptose, 5 g de lactose, 2,75 g de
K2HPO4, 2,75 g de KH2PO4, 34,22 g de NaCl et 0,1 g de
sulfate sodique de lauryle dans 1 litre d'eau
distillée. Autoclaver à 121oC pendant
15 minutes. Préparer une solution 10 mg/ml de
vancomycine dans de l'eau distillée.
Stériliser par filtration à l'aide d'un
filtre 0,2 µm, puis transférer I ml de solution
de vancomycine dans 1 litre de bouillon LST modifié
refroidi (moins de 50oC). Utiliser ce bouillon
dans les 24 heures.
*Vous pouvez utiliser un milieu LST disponible dans le
commerce, mais vous devrez ajouter une quantité
supplémentaire de NaCI (29,22 g/litre) au bouillon
avant d'autoclaver.
- Enrichissement secondaire - bouillon BHI
(disponible dans le commerce)
- Milieu de confirmation - Gélose nutritive
(disponible dans le commerce)
- Tablettes d'alpha-glucosidase (Rosco : Diatab
50421, site Web :  www.rosco.dk)
3) Matériel
Équipement :
- Stomacher
- Incubateur
- Autre (fourni avec la trousse de démarrage du
système BAX®)
- Cycleur/détecteur avec plaques de
vérification
- Poste de travail informatique avec le système
d'exploitation Microsoft Windows®, le logiciel du
système BAX® et une imprimante. Blocs de
chauffage avec dispositif d'ancrage à
thermomètres pour les tubes de lyse
- Outils de capsulage/décapsulage
- Pipettes variées pour le transfert des
réactifs et des échantillons
- Blocs de refroidissement avec dispositif d'ancrage
pour les tubes de lyse et les tubes PCR
- Supports pour tubes PCR
Fournitures :
- Tubes de lyse avec bouchons et supports
- Embouts de pipette
- Gants de nitrile sans poudre
- Guide d'utilisation du système BAX®
7. MARCHE À SUIVRE
7.1 Prélèvement et enrichissement des
échantillons
7.1.1 Mélanger 25 g d'échantillon dans
225 ml de bouillon mLST avec vancomycine.
7.1.2 Incuber à 45oC pendant 20 à
22 heures.
7.1.3 Ajouter 10 µL d'échantillon enrichi
à 500 µL de bouillon de BHI (à la
température de la pièce).
7.1.4 Incuber à 37oC pendant trois
heures.
7.2 Préparation de l'équipement (Se reporter
au Guide d'utilisation du système BAX® pour
plus de détails)
7.2.1 S'assurer que les blocs de refroidissement
ont été réfrigérés pendant la
nuit.
7.2.2 Faire chauffer les blocs de chauffage et
s'assurer que les températures sont
réglées à 37oC et
95oC.
7.2.3 Mettre en marche le cycleur/détecteur du
système BAX® (effectuer la vérification,
si demandé).
7.2.4 Créer un fichier de support.
7.2.5 Sélectionner RUN FULL PROCESS dans la barre
de menu pour réchauffer le cycleur/détecteur.
7.3 Préparation des échantillons
7.3.1 Lyse des échantillons
7.3.1.1 Placer le nombre voulu de tubes de lyse (un
pour chaque échantillon et un pour le
témoin) dans le support conformément au
fichier de support.
7.3.1.2 Préparer le réactif de lyse en
pipettant 150 µL de protéase dans une
bouteille de tampon de lyse de 12 ml.
7.3.1.3 Ajouter 200 µL de réactif de lyse
dans chaque tube de lyse.
7.3.1.4 Transférer 5 µL
d'échantillon enrichi au tube de lyse
correspondant.
7.3.1.5 Bien fermer les bouchons et chauffer les
tubes à 37oC pendant 20 minutes,
puis à 95oC pendant 10 minutes.
7.3.1.6 Placer les tubes de lyse dans le bloc de
refroidissement pendant au moins 5 minutes.
7.3.2 Préparation des échantillons pour la
PCR
7.3.2.1 Placer le support à tubes PCR dans le
bloc de refroidissement PCR.
7.3.2.2 Placer un tube PCR pour chaque
échantillon dans le support.
7.3.2.3 Retirer et jeter le couvercle d'une
bandelette de tubes à la fois.
7.3.2.4 Utiliser une pipette à canaux multiples
pour transférer 50 µL de chaque
échantillon lysé dans un tube PCR
correspondant.
7.3.2.5 Reboucher les tubes avec une nouvelle
bandelette de bouchon optique et bien refermer.
Répéter pour tous les échantillons.
7.3.2.6 Déposer le bloc entier de
refroidissement dans le cycleur/détecteur. Les
échantillons devraient rester dans le bloc de
refroidissement jusqu'à ce que le
cycleur/détecteur soit prêt à
être chargé, mais pour une période
n'excédant pas 30 minutes après
l'hydratation de la tablette.
7.4 Traitement des échantillons
Suivre à l'écran les directives de
l'assistant PCR pour charger vos échantillons,
exécuter le programme, puis retirer vos
échantillons, tel que précisé dans le Guide
d'utilisation.
7.5 Analyse des résultats
8. CONFIRMATION DES RÉSULTATS POSITIFS
8.1 A partir des enrichissements originaux, ensemencer des
boîtes de gélose nutritive.
8.2 Incuber les boîtes de gélose nutritive
à 37 ± 1oC pendant 24 heures, puis
retirer les boîtes de l'incubateur et les placer
sous la lumière pendant 4 heures à la
température de la pièce.
8.3 Prélever jusqu'à 5 colonies jaunes et
effectuer une épreuve de confirmation
alpha-glucosidase de la façon suivante :
8.3.1 Transférer 0,25 ml de solution saline dans
un petit tube en verre.
8.3.2 Suspendre 2à 3 colonies jaunes et une
tablette de diagnostic dans la solution saline en
produisant des tourbillons.
8.3.3 Incuber dans un bain-marie à 37 ±
1oC pendant 4 heures.
8.3.4 Observer la couleur du liquide : si le liquide
est jaune vif, le résultat est positif.
REMARQUE : Vous devriez aussi
effectuer un contrôle positif E. sakazakii et un
contrôle négatif de la solution saline
stérile.
8.4 Si les colonies ci-dessus donnent des résultats
négatifs, sélectionner jusqu'à 5
colonies blanches (Enterobacter sakazakii
atypique) et les soumettre à une épreuve
d'alpha-glucosidase.
8.5 Des résultats positifs à l'épreuve
d'alpha-glucosidase sont considérés
présumés et exigent une identification
biochimique (API 20E) ou moléculaire (système
RiboPrinter®) plus poussée pour confirmer la
présence d'Enterobacter sakazakii.
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