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Procédure de laboratoireMFLP-31
Mai 2005
(Version PDF)
IDENTIFICATION DE LISTERIA MONOCYTOGENES AU MOYEN DU SYSTÈME DE LA RÉACTION EN CHAÎNE DE LA POLYMÉRASE EN TEMPS RÉEL (PCR TEMPS RÉEL) DE WARNEXTM
Stephen Shaw et Jessica Bosley
Section du développement technologique, Laboratoire d'Ottawa (Carling) Agence canadienne d'inspection des aliments
Ottawa (Ontario) K1A 0C6
Courriel : sshaw@inspection.gc.ca
bosleyj@inspection.gc.ca
1. APPLICATION
Cette méthode s'applique à l'identification rapide de Listeria monocytogenes (LM) isolés dans les aliments et autres échantillons au moyen des techniques classiques de culture de LM, MFHPB-30 (6.1), MFLP- 74 (6.2), d'autres méthodes de la DGPSA et d'autres méthodes de détection de Listeria non incluses dans le Compendium. Cette méthode peut être appliquée à l'identification présomptive des espèces de Listeria dans des bouillons d'enrichissement sélectif de culture. Si des mesures de conformité fondées sur les produits sont prévues, et lorsque stipulé, seule la méthodologie de la DGPSA doit être employée. Elle doit aussi servir à confirmer les colonies trouvées positives par la réaction en chaîne de la polymérase en temps réel (PCR temps réel).
Cette méthode révisée remplace la méthode MFLP-31 datée de juin 2003.
2. PRINCIPE
Après la procédure d'enrichissement en bouillon sélectif (bouillon Fraser) pour les aliments, ingrédients alimentaires et échantillons environnementaux, le bouillon est soumis à la réaction PCR temps réel qui amplifie une séquence d'ADN spécifique unique à LM. Le système PCR en temps réel par fluorescence utilise des amorces d'oligonucléotides hautement spécifiques à LM et n'amplifient pas l'ADN provenant d'autres organismes non-LM dans les conditions de la réaction. Le fragment d'ADN ainsi amplifié a une masse moléculaire spécifique définie par les amorces et est facile à identifier par des lectures de fluorescence spécifiques à LM. La procédure complète, après l'étape d'enrichissement sélectif (bouillon Fraser), permet d'identifier en 3 heures les échantillons positifs présomptifs et peut remplacer les tests usuels de dépistage et de confirmation, ce qui constitue une économie considérable de temps, de main d'œuvre et d'argent (en coût d'analyse). Cette technique PCR s'est révélée une méthode spécifique et sensible pour l'identification présomptive des souches de L. monocytogenes à partir de divers échantillons.
Le système de détection rapide de pathogènes de WarnexTM par PCR en temps réel pour LM a été validé par l'AOAC-RI et a reçu le statut de « Performance Tested Method » en 2004, Numéro du certificat : 040402.
* WarnexTM est une marque de commerce de Warnex Diagnostique inc., 3885, boulevard Industriel, Laval (Québec), Canada, H7L 4S3.
Téléphone : (450) 663-6724, Télécopieur : (450) 669-2784, Site web :  http://www.warnex.ca
3. AMORCES SPÉCIALISÉES, RÉACTIFS, TAMPONS, MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENT
| NOTE: Il est de la responsabilité du superviseur du laboratoire de voir à ce que l'analyse décrite dans cette méthode soit réalisée en accord avec la Norme Internationale intitulée « ISO/IEC 17025:1999 (ou version plus récente) : Prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d'étalonnages et d'essais ». |
3.1. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENT
3.1.1 Matériel et équipement spéciaux fournis
Tampon d'extraction (EX-1)
Réactif d'extraction, lyophilisé (EX-2)
Plaques d'extraction
Scellant pour plaques
Tampon de détection (DT-1)
Réactif de détection, lyophilisé (DT-2)
Plaques de détection (contenant les réactifs PCR et les amorces pré-distribués)
Bandes de bouchons optiques en plastique pour PCR
3.1.2 Matériel additionnel et équipements spéciaux requis
Thermocycleur PCR en temps réel validé par Warnex*
* Spécifications du thermocycleur :
- capacité d'analyser une microplaque«low profile» de 96-puits ou 96 tubes PCR «low profile» de 0.2 ml.
- capacité d'exciter des fluorophores ayant un pic d'émission autours de 485 à 520 nm.
- capacité d'exciter des fluorophores ayant un pic d'émission autours de 500 à 600 nm.
Vortex (avec adaptateurs pour plate-forme)
Centrifugeuse (avec rotor et adaptateur pour plaque)
Appareil «stomacher »
Sacs «stomacher» avec filtre
Micro-pipettes couvrant des volumes variant de 0,5 à 1000 μl et embouts stériles avec filtres
3.2 AMORCES PCR, PROGRAMME DES CYCLES DE TEMPÉRATURE, TAMPONS ET RÉACTIFS
3.2.1 Amorces PCR
Les amorces d'oligonucléotide et les phares moléculaires sont fournis dans chaque trousse de détection et leur spécificité pour LM a été vérifiée (6.3).
3.2.2 Programmes des cycles de température
Les programmes des cycles de température de la réaction PCR incluent un cycle automatisé d'extraction de 15 minutes favorisant la lyse des cellules bactériennes suivi d'un programme automatisé de détection. L'étape de la détection (amplification) est prédéterminée par le programme du thermocycleur selon les paramètres suivants :
Amplification :
1 cycle de :
Démarrage, 15 minutes, 95ºC
40 cycles de :
Dénaturation, 15 secondes, 94ºC
Hybridation, 15 secondes, 55ºC
Lecture de plaques
Extension, 15 secondes, 72ºC
3.2.3 Tampons et réactifs
Tous les tampons et les réactifs sont fournis par la firme Warnex Diagnostiques inc. Dans la trousse. Ceci inclut les réactifs requis pour l'extraction de l'ADN (EX-1, EX-2) et les réactifs de détection (DT-1, DT-2). Tous les autres réactifs et tampons de détection sont déjà pré-distribués dans les puits de la plaque de détection. L'eau, les micro-pipettes, les embouts de pipette et tout le matériel entrant en contact avec les échantillons ou les réactifs PCR temps réel devraient être stériles et sans ADNase et/ou autoclavés avant usage afin d'éliminer toute trace d'ADNase ou d'autres contaminants.
4. PROCÉDURE
4.1 Manipulation des échantillons
Les unités d'échantillonnage sont manipulées et soumises aux procédures d'enrichissement d'isolement et d'ensemencement selon les méthodes utilisées par Santé Canada (6.1, 6.2) ou par d'autres méthodes validées de détection des Listeria. Le bouillon Fraser est analysé par la technique PCR selon les instructions indiquées ci-dessous. Un témoin positif constitué d'une souche de L. monocytogenes cultivée dans un bouillon de culture et un témoin négatif constitué d'un organisme autre que L. monocytogenes sont tous deux soumis à l'analyse avec chaque groupe d'échantillons. Un témoin négatif de stérilité des réactifs est aussi soumis à l'analyse avec chaque groupe d'échantillons.
4.2 Extraction de l'ADN
4.2.1 Verser le contenu de la bouteille EX-1 (bouteille de plastique souple) dans le vial EX-2 pour obtenir la solution EX-2 reconstituée. Refermer le vial et agiter par inversion pour assurer la complète dissolution du réactif déshydraté. Verser la solution EX-2 reconstituée dans un bassin pour pipette à multi-canaux.
4.2.2 Placer 90 μl de la solution EX-2 reconstituée dans chaque puits de la plaque d'extraction de 96 puits (un puits par extraction).
4.2.3 Transférer 10 μl de la suspension de cellules (étape 4.1) dans les puits de la plaque d'extraction à l'aide d'une pipette à canal simple, selon le schéma prédéterminé.
4.2.4 Sceller les puits de la plaque d'extraction avec les bandes de bouchons fournis.
4.2.5 Placer la plaque d'extraction dans le thermocycleur et fermer le couvercle.
4.2.6 Débuter le programme d'extraction du thermocycleur.
4.2.7 Lorsque le programme d'extraction est complété, retirer la plaque d'extraction.
4.2.8 Tous les microorganismes sont maintenant lysés et inactivés.
4.2.9 Centrifuger la plaque d'extraction pendant 5 minutes à 1,800 x g.
4.2.10 Le surnageant peut maintenant être utilisé pour la méthode d'amplification par PCR.
4.3 Méthode d'amplification par PCR
4.3.1 Verser le contenu de la bouteille DT-1 (bouteille de plastique souple) dans le vial DT-2 pour obtenir la solution DT-2 reconstituée. Refermer le vial et agiter par inversion pour assurer la complète dissolution du réactif déshydraté. Verser la solution DT-2 reconstituée dans un bassin pour pipette à multi-canaux.
4.3.2 Prendre une plaque de détection et la retirer de l'enveloppe.
4.3.3 Placer 15 μl de la solution DT-2 reconstituée dans la plaque de détection contenant 96 puits à l'aide d'une pipette multi-canaux.
4.3.4 Transférer 10 μl d'extrait d'ADN provenant de chaque puits de la plaque d'extraction dans les puits de la plaque de détection.
4.3.5 Sceller la plaque d'extraction en utilisant les scellants fournis et entreposer la plaque à 4°C jusqu'à ce que l'analyse soit complétée.
4.3.6 Sceller la plaque de détection avec les bandes de bouchons optiques pour PCR fournis.
4.3.7 Vortexer la plaque de détection pendant 1 minute.
4.3.8 Centrifuger la plaque de détection pendant 1 minute à 1,800 x g. Cette étape est nécessaire pour s'assurer que les réactifs PCR ainsi que l'échantillon d'ADN se retrouvent bien au fond des puits de la plaque PCR.
4.3.9 Bien fixer la plaque de détection dans l'appareil PCR. S'assurer que le puits A1 se retrouve dans le coin supérieur gauche. Fermer le couvercle de l'appareil PCR et sélectionner l'icône «Start Detection» pour débuter l'analyse.
4.3.10 Lorsque le programme de détection sera complété, enlever la plaque de l'appareil et en disposer.
5. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
L'amplicon (produit de la réaction PCR) généré à partir des séquences du gène de Listeria monocytogenes par la présente méthode PCR est un fragment d'ADN double brin. Lors d'un résultat PCR positif, la réponse mesurée par fluorescence sera plus élevée que celle du seuil de référence exprimé par les témoins négatifs en moins de 40 cycles d'amplification de la réaction PCR. La valeur seuil de référence de la fluorescence est déterminée et établie par l'appareil PCR. Un résultat négatif n'émettra normalement pas de fluorescence. S'il y a émission de fluorescence au-dessus de la valeur du seuil de référence dans les témoins négatifs, les résultats du test ne sont pas valides et l'analyse doit être reprise après avoir pris soin d'éliminer toutes les sources d'erreur possibles. Tout échantillon trouvé positif au moyen de la technique PCR de Warnex doit être confirmé en procédant à une culture, surtout si des mesures de conformité sont prévues.
6. RÉFÉRENCES
6.1 Pagotto, F., E. Daley, J. Farber et D. Warburton. 2001. MFHPB-30. Isolement de Listeria monocytogenes dans tous les types d'aliments et dans les échantillons environnementaux . Dans: Volume 2, Compendium de méthodes, Site Web: http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/index_f.html.
6.2 Pagotto, F., E. Daley et J. Farber. 2002. MFLP-74. Dénombrement de Listeria monocytogenes dans les aliments. Dans: Volume 3, Compendium de méthodes, Site Web: http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/index_f.html.
6.3 Warnex Recherche Inc. 2002. Validation de la technique PCR en temps réel pour l'identification rapide des souches de Listeria monocytogenes dans les aliments et autres échantillons. Communication personnelle (données non publiées).
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