Aliments > Produits de viande et de volaille > Manuel des méthodes > Chapitre 4 Chapitre 4 Annexe OPolitique relative au contrôle des Date dentrée en vigueur: Cette politique est effective en date de sa publication et tous les exploitants détablissements agréés produisant ou manipulant du boeuf cru sont tenus de ré-évaluer leur système HACCP ou leur contrôles de procédés (voir point numéro 1), de mettre en oeuvre une/des étape(s) de réduction des agents pathogènes si elles ne sont pas déjà en place, de valider leurs système HACCP et de mettre en oeuvre une procédure de vérification. Politique: À la lumière des données dont on dispose sur la présence dE. coli O157:H7 chez les bovins, selon lesquelles les taux de contamination sont plus élevés quon croyait, les établissements qui produisent ou reçoivent du boeuf cru doivent réévaluer leur système HACCP pour prendre en considération les dangers associés à E. coli O157:H7 dans le boeuf cru. Aux fins de la présente politique, le terme boeuf cru comprend la viande de veau, le cur, la viande de tête, la viande de bajoue, lsophage, etc. (c.-à-d. les muscles striés) mais exclut les queues et les langues de boeuf/veau puisque ces portions sont généralement entièrement cuites et nont jamais été liées à des toxi-infections alimentaires . Le boeuf cru comprend le boeuf cru intact et non intact. Une coupe de boeuf cru intacte est un morceau de viande dont lintégrité na pas été modifiée, cest-à-dire que les bactéries sont à la surface et que lintérieur est probablement stérile. Le boeuf cru non intact est constitué de boeuf qui a été attendri à laide daiguilles, soumis à des injections, coupé en cubes ou haché. 1. Les exploitants de tous les établissements qui produisent ou reçoivent des produits de boeuf crus pour la transformation doivent réévaluer leur système HACCP afin de déterminer si la contamination par E. coli O157:H7 constitue un danger possible pendant la production de ces produits et, si cest le cas, si leur système HACCP permet de lutter efficacement contre ce danger. Si létablissement ne possède pas de système HACCP, lexploitant doit élaborer et mettre en uvre des mesures délimination étayées par des documents, validées et auditables pour réduire ce danger spécifique. Aux fins de la présente section, le terme « système HACCP » comprend tous les moyens de contrôle des processus fondés sur HACCP que doit utiliser lexploitant pour lutter contre E. coli O157:H7 même sil nest pas encore reconnu par le PASA. 2. Selon les renseignements disponibles, il est évident que la contamination du boeuf cru par E. coli O157:H7 représente un danger possible pour la santé et quil est nécessaire de mettre en uvre des mesures pour réduire ce danger. Cependant, si un exploitant conclut, à la suite de la réévaluation, quil est peu probable quil existe un danger de contamination par E. coli O157:H7 des produits de boeuf crus produits à létablissement, cette conclusion devra être appuyée par des preuves scientifiques (p.ex., littérature, données, etc.). Linformation sera examinée par lACIA à la lumière des données scientifiques existantes. Il faut se rappeler quE. coli O157:H7 est considéré comme un adultérant dans le boeuf haché aux États-Unis et justifie un rappel lorsque des résultats positifs sont obtenus au Canada. Par ailleurs, on peut utiliser des produits de boeuf crus intacts ou non intacts pour produire du boeuf haché cru (voir lintroduction pour la définition ainsi que le paragraphe 11 pour de plus amples renseignements sur les produits de boeuf intacts). Ces exigences visent à sassurer que les mesures appropriées de lutte contre la contamination sont adoptées à la suite de la réévaluation approfondie du système HACCP de létablissement. 3. Lorsque lexploitant a conclu, à la suite de la réévaluation, quil existe un danger probable de contamination par E. coli O157:H7 des produits de boeuf crus produits à létablissement, on doit de revoir les formules du PASA (ou léquivalent) portant sur lidentification du produit et lusage prévu pour évaluer si les renseignements quils renferment sont complets et exacts. Le danger associé à E. coli O157:H7 devrait être clairement indiqué sur la formule no 5 du PASA. Ensuite, il faut évaluer le danger en se servant de larbre de décision (formule no 8 du PASA). Lexploitant doit décider des moyens quil prendra pour éliminer le danger : soit CCP à létablissement au cours de la production, lettre de garantie des fournisseurs à la réception de produits de boeuf crus ou autres mesures visant à empêcher la distribution de produits qui pourraient être contaminés. Lexploitant doit sassurer que tous les volets du système HACCP de létablissement sont mis à jour comme il se doit. 4. Lexploitant doit sassurer que le taux dE. coli O157:H7 dans les produits de boeuf distribués ailleurs que dans un établissement agréé par le gouvernement fédéral se situe sous le seuil de détection (c.-à-d. quaucune bactérie E. coli O157:H7 nest détectée dans un échantillon analysé à laide dune des méthodes de détection rapide (screening) reconnues officiellement par Santé Canada : p.ex. méthode MFLP-81 (BioControl Assurance), MFLP-87 (BioControl VIP), MFLP -94 & 95 (Reveal 8 hours and 20 hours) and MFLP-30 (Dupont BAX). et les tests de confirmation, pour les échantillons trouvés positifs à laide de lune des méthodes de détection rapide seront complétés avec la méthode ci-jointe de séparation Immunimagnétique). Il est entendu que, dans tous les cas, des mesures doivent être en place dans létablissement pour empêcher la croissance dE. coli O157:H7 ou la contamination par cette bactérie. Les mesures suivantes de lutte contre la contamination doivent être appliquées: a) Dans un abattoir, à la suite de la réévaluation du système HACCP de létablissement, lexploitant doit avoir recours à une ou plusieurs interventions validées (comme la pasteurisation à la vapeur, la vaporisation avec des acides organiques, etc... validés selon cette politique) au moment de labattage afin de réduire la contamination par E. coli O157:H7 à un niveau en deçà du seuil de détection. b) Dans un établissement qui reçoit du boeuf cru, à la suite de la réévaluation du système HACCP, lexploitant peut :
c) Dans un établissement qui produit du boeuf cru destiné exclusivement à la fabrication de produits bien cuits dans dautres établissements agréés par le gouvernement fédéral, lexploitant peut déterminer, à la suite de la réévaluation du système HACCP de létablissement, quil existe un danger probable de contamination par E. coli O157:H7, mais quaucun nouveau CCP nest nécessaire dans létablissement parce que tous les produits sont expédiés vers un autre établissement agréé par le fédéral où des mesures seront prises pour éliminer le danger. Lexploitant doit alors fournir des détails sur les mesures délimination du danger qui seront mises en place : par exemple, le produit portant le sceau de lentreprise est expédié vers un établissement agréé par le gouvernement fédéral et sera transformé tel quil est prévu (lexploitant de létablissement destinataire fournit une lettre de garantie selon laquelle la cuisson éliminera le danger) ou le produit porte une mention claire telle que « Produit destiné à être transformé en un produit bien cuit ». Les procédures doivent comprendre des activités de surveillance, de vérification et de tenue des dossiers ainsi que des procédures de rectification. De plus, ces procédures doivent être auditables et efficaces. 5. Lorsque lexploitant décide que lune des mesures de lutte à prendre à létablissement est associée à des spécifications dachat, les éléments suivants doivent être pris en considération et portés aux dossiers : a) Le dossier doit comporter une lettre de garantie des fournisseurs indiquant les interventions et les autres mesures quils utilisent pour réduire, empêcher ou éliminer le danger associé à E. coli O157:H7(c-à-d sous le seuil de détection). La lettre doit être datée et signée par lexploitant, ou une personne désignée, de létablissement expéditeur. La lettre doit comporter une déclaration selon laquelle, advenant que les interventions du fournisseur se révèlent inefficaces et quun résultat positif soit obtenu, linspecteur de lACIA de létablissement fournisseur et tous les établissements qui ont reçu du produit impliqué seront avisés. Note: Lorsque du produit impliqué a été distribué, le Bureau de la salubrité et des rappels alimentaires doit être avisé (voir également le paragraphe 12). b) Comme étape de vérification du CCP de réception, létablissement destinataire doit sassurer que les interventions du fournisseur sont efficaces en effectuant des analyses aléatoires sur les produits quil reçoit. La fréquence de ces analyses est déterminée par lexploitant et doit être fondée sur la connaissance de laptitude de leurs fournisseurs à rencontrer les spécifications dachat. Une alternative acceptable aux analyses aleatoires à la reception serait dexiger des certificats danalyse des fournisseurs démontrant que le produit est sous le seuil de détection. Ces analyses devrait être effectuées dans un laboratoire independant utilisant les méthodes officielles. Nota : Le certificat danalyse ne doit pas être considéré comme une lettre de garantie. La lettre de garantie confirme que le processus de fabrication du produit est maîtrisé et que les spécifications dachat sont respectées. Le certificat danalyse fournit des renseignements additionnels sur les résultats des analyses pour un lot précis. Bien quil augmente le niveau de confiance, le certificat danalyse ne peut remplacer la lettre de garantie. 6. Lorsque létablissement manipule à la fois des produits de boeuf crus dont le taux dE. coli O157:H7 se situe en deçà du seuil de détection et des produits de boeuf pouvant être contaminés par E. coli O157:H7, lexploitant doit élaborer et mettre en uvre des mesures de ségrégation écrites qui prennent en compte létat des différents produits. Les renseignements pertinents doivent être inscrits sur les formules du PASA (possibilité de contamination croisée). Les mesures de ségrégation doivent comprendre des activités de surveillance, de vérification et de rectification ainsi que des procédures de tenue des dossiers. De plus, ces mesures doivent être auditables et efficaces. Par exemple, il nest nécessaire de fournir une lettre de garantie concernant E. coli O157:H7 que pour les produits reçus en vue de la fabrication de produits de boeuf crus et non pour les produits qui seront cuits. Des mesures de ségrégation doivent être adoptées afin que les produits de boeuf crus destinés à la cuisson ne soient pas utilisés dans la production de produits de boeuf crus finis et pour empêcher la contamination croisée. 7. Les mesures prises en vertu du système HACCP devraient être élaborées conformément aux lignes directrices du PASA. LorsquE. coli O157:H7 est détecté, lexploitant doit réévaluer le système HACCP de létablissement, prendre les actions correctives qui simposent et mettre en uvre des mesures préventives (voir le paragraphe 13). Lorsque lexploitant a conclu, à la suite de la réévaluation du système HACCP de létablissement, que des mesures autres que des CCP sont nécessaires pour éliminer le danger associé à E. coli O157:H7 (voir le paragraphe 4c), ces autres mesures doivent comprendre des activités de surveillance, de vérification et de rectification ainsi que des procédures de tenue des dossiers. De plus, ces mesures doivent être auditables et efficaces. 8. La validation des étapes de réduction de pathogènes (CCP) de létablissement doit être effectuée conformément à lapproche du PASA. Le PASA définit la validation comme suit : obtenir une confirmation que les éléments d'un système HACCP sont complets et permettent de maîtriser efficacement les dangers biologiques, chimiques et physiques. La confirmation peut nécessiter, notamment, un échantillonnage des ingrédients, des produits finis, etc. Dans le cas présent, il faut plus précisément faire ces 3 étapes : Étape 1 rassembler des données scientifiques publiées sur la réduction expérimentale obtenue avec la méthode choisie pour réduire le taux de lagent pathogène et sur tous les facteurs critiques pertinents (p. ex. lintervention « Y » devrait entraîner une réduction de 2,0 log selon les paramètres définis relativement aux conditions expérimentales comme la pression, la température, la durée, la concentration chimique, etc.); Étape 2 démontrer lefficacité de la méthode pour réduire le taux dune bactérie substitut acceptable de « X » log dans les conditions dexploitation de létablissement (c.-à-d. lintervention « Y » permet de réduire de « X » log les taux d'E. coli génériques ou dentérobactéries utilisés comme indicateurs) pour chacune des interventions que létablissement a choisi de mettre en uvre. Une bactérie substitut acceptable est un organisme qui a une résistance thermique, une plage de croissance, une plage de pH, une habilité de croître sur des milieux sélectifs etc. Qui sont similaires à E. coli O157:H7. Normalement, pour ce faire, on compare les taux de la bactérie substitut dans léchantillon avant et après lintervention. Lexploitant doit choisir un échantillon dune taille statistiquement significative prélevé sur une période de 4 mois pour démontrer que lintervention sur place permet dobtenir la réduction de log visée. E. coli O157:H7 ne doit pas être introduit à des fins expérimentales dans les établissements agréés (voir lannexe 4 pour obtenir des conseils sur la taille de léchantillon et lanalyse statistique). Léchantillonnage des carcasses doit être effectué conformément à lannexe T, section sur les États-Unis, chapitre 11 du Manuel des méthodes de lhygiène des viandes. Étape 3 veiller à ce que, à la suite de toutes les réductions logarithmiques des interventions (CCP), le taux d'E. coli O157:H7 dans le produit final soit en deçà du seuil de détection. La démonstration devrait être fondée sur un nombre déchantillons de produit fini statistiquement significatif, cest-à-dire que le taux d'E. coli O157:H7 devrait être en deçà du seuil de détection, avec un niveau de confiance à 95 %. En raison de la variabilité attendue d'E. coli O157:H7, léchantillonnage de validation devrait se faire en choisissant au hasard le nombre requis déchantillons durant une période de production de un mois tel que lindique le Tableau 1. Léchantillonnage minimal requis par lACIA est indiqué à la colonne correspondant au seuil de 1 %. Léchantillonnage des carcasses doit être effectué conformément à lannexe T, section sur les États-Unis, chapitre 11 du Manuel des méthodes de lhygiène des viandes. Nota 1 : Si la taille du lot (c.-à-d. le nombre danimaux abattus par mois) se situe entre deux valeurs figurant à la colonne 1 du tableau 1, il faut choisir le nombre le plus élevé pour déterminer la taille de léchantillon. Nota 2 : Exceptionnellement, lorsquune méthode de transformation approuvée, comme la fermentation, cuisson et la mise en conserve, est déjà reconnue pour son pouvoir de létalité et mise en application en vertu des exigences réglementaires, il ny a pas lieu de recourir à dautres activités de validation comme celles décrites ci-dessus à létablissement. Dautres processus pourraient faire lobjet dexemptions à la suite dune évaluation par lAdministration centrale. Nota 3 : Il revient à chaque établissement de décider sil désire recourir ou non aux services dun laboratoire agréé pour les analyses requises pour la validation ou la vérification. Cependant, dans tous les cas, les laboratoires DOIVENT se servir dune méthode reconnue officiellement par lACIA (voir point 4 de cette section). Les résultats de laboratoire (certificats danalyse en laboratoire) doivent indiquer la méthode utilisée pour lanalyse des échantillons. La validation doit être complétée initialement afin de démontrer que les interventions mise en place par lexploitant sont efficaces pour produire des produits de viande qui sont sous le seuil de détection de E. coli O157:H7. Une nouvelle validation doit être menée à nouveau lorsque lexploitant a modifié les étapes de production et/ou quune étape de réduction des pathogènes a été modifiée/ajoutée lorsquun échantillon de produit sest avéré positif à E. coli O157:H7, le système HACCP en entier doit être réevalué et, après que les changements nécessaires ont été mis en oeuvre, au moins la 3ième étape de la validation doit être complétée afin de démontrer que létablissement est de nouveau sous contrôle. 9. La vérification doit être effectuée conformément au PASA. Dans le cas présent, cela signifie plus précisément que : a. les dossiers sont examinés; b. des examens sur place sont effectués de façon à sassurer que le programme écrit est mis en uvre conformément aux plans; c. le produit est soumis à de façon aléatoire et routinière à un test de dépistage d'E. coli O157:H7 à une fréquence appropriée ou les certificats danalyse se reçus; d. un audit des fournisseurs (facultatif) peut aussi être effectué à titre dactivité de vérification. Aucune fréquence nest prévue pour ces activités. Il incombe à lexploitant de procéder à ces activités à une fréquence qui permettra de garantir que le produit fini satisfait aux exigences applicables. Nota : Les certificats danalyse (effectués par un laboratoire indépendant) transmis par les fournisseurs peuvent remplacer les rapports sur les activités de vérification de létablissement destinataire. 10. Les lignes directrices suivantes devraient être utilisées pour définir un lot lorsquune carcasse, des parures, du boeuf destiné à la transformation ou du boeuf haché sont positifs au test de dépistage d'E. coli O157:H7 : a) En ce qui concerne le boeuf haché, consulter la ligne directrice no 10 de Santé Canada : (http://www.hc-sc.gc.ca/food-aliment/mh-dm/mhe-dme/rfao-aoca/f_lignes_directrices_sur_boeuf_hache.html). b) En ce qui concerne les carcasses, les parures et le boeuf destiné à la transformation, lACIA se réfèrera à la ligne directrice no 10 de Santé Canada. LACIA reconnaîtra la définition du lot soumis à léchantillonnage fournie par létablissement, pourvu que ce dernier ait un plan déchantillonnage et se soit appuyé sur des données scientifiques pour définir ce lot. Cependant, lACIA tient à souligner que la définition de la taille du lot ne relève pas létablissement de sa responsabilité qui consiste à examiner sil existe des liens entre les lots. Par exemple, si de multiples lots de parures de boeuf ont été produits à partir de matériel source provenant du même lot de production dun fournisseur unique et quune partie de ce lot est contaminée par E. coli O157:H7, lACIA sattend à ce que létablissement justifie, en sappuyant sur des données scientifiques, pourquoi toutes les parures produites à partir de ce matériel source ne devraient pas être considérées comme contaminées. Si lexploitant est incapable de fournir une justification scientifique satisfaisante, lACIA considérera que le lot par défaut englobe les produits transformés entre la séance de nettoyage et de désinfection précédente jusquà la suivante. c) De même, en ce qui concerne les carcasses, si on détecte la présence d'E. coli O157:H7 dans une carcasse, lACIA sattend à ce que létablissement explique pourquoi il a pu déterminer que les autres carcasses produites le même jour, sur la même ligne, ne sont pas elles aussi contaminées par E. coli O157:H7. Il faut souligner que si un exploitant possède un système HACCP validé et quil vérifie par des tests réguliers que des lots précis de produits sont exempts d'E. coli O157:H7, les données obtenues pourraient lui permettre de déterminer quun lot contaminé par E. coli O157:H7 est le seul lot contaminé impliqué de la journée. 11. Il faut mentionner que les produits de boeuf crus intacts utilisés tels quels par les consommateurs ne comportent pas le même niveau de risque que les produits non intacts. Contrairement aux produits de boeuf crus non intacts, lintérieur des produits de boeuf crus intacts est considéré comme étant exempt dagents pathogènes. Par conséquent, la cuisson habituelle de ces produits détruira tout E. coli O157:H7 qui pourrait être présent à la surface. Lexploitant devra déterminer si tout le boeuf cru intact produit à létablissement demeurera intact jusquà sa consommation (p.ex. biftecks préemballés) ou sil est possible quil soit utilisé pour la production de produits de boeuf crus non intacts (p.ex. coupes primaires dont les parures peuvent servir à la production de boeuf haché vendu au détail). Tout le boeuf cru non intact devra être produit dans des conditions contrôlées afin quon soit sûr quil ne renferme pas de quantités décelables d'E. coli O157:H7 ou il devra être utilisé, dans un établissement agréé par le fédéral, pour la production de produits prêts à manger bien cuits en vertu dun plan HACCP qui élimine le danger de contamination par E. coli O157:H7. Comme tous les établissements qui produisent du boeuf cru, un établissement qui produit et distribue du boeuf cru intact (p.ex. bifteck) doit réévaluer son système HACCP pour ce produit à la lumière des données pertinentes sur E. coli O157:H7 afin de déterminer si le système permet déliminer adéquatement le danger. Un établissement qui produit et distribue des biftecks préemballés intacts pourrait conclure quil nest pas nécessaire quil modifie son système HACCP pour ces produits. 12. À lexception des cas couverts au point 4c), lorsquun établissement qui reçoit du boeuf cru fournit à son tour des produits de boeuf crus à un autre établissement, les lignes directrices suivantes sappliquent : a) les deux établissements doivent adopter des spécifications dachat pour empêcher lintroduction d'E. coli O157:H7 dans leurs installations et avoir un protocole de dépistage d'E. coli O157:H7 dans le cadre de leurs activités de vérification. Dans ce cas, la lettre de garantie fournie par létablissement qui reçoit et expédie du boeuf cru devrait indiquer que:
b) en plus dadopter des spécifications dachat pour lutter contre cette bactérie, les établissements destinataires doivent sassurer que des mesures sont en place pour empêcher la croissance d'E. coli O157:H7 ou la contamination par cette bactérie après la réception du produit dans le cadre de leurs programmes préalables. Dans ce cas, aucun échantillonnage supplémentaire neest requis pour la vérification des produits finis. Pour de plus amples renseignements sur la lettre de garantie, voir le paragraphe 5. 13. Détection d'E. coli O157:H7 à la suite des analyses de validation ou de vérification : Avant de prélever un échantillon pour la recherche d'E. coli O157:H7, lexploitant doit isoler et clairement identifier le lot à la satisfaction de linspecteur de lACIA de façon à sassurer que le produit nest pas incorporé dans un produit de boeuf cru fini. On recommande de retenir le lot en attendant les résultats du laboratoire. Lexploitant doit aussi indiquer le numéro de létablissement expéditeur (si le produit provient dun autre établissement), la date de production, le numéro de lot de production et toute autre information pertinente sur le lot. Sil reçoit un résultat positif ou présumé positif, lexploitant doit immédiatement retenir le lot et empêcher quil ne soit utilisé. Lexploitant doit également aviser immédiatement le fournisseur de ce lot et linspecteur responsable de lACIA. Lexploitant devra soit cuire entièrement le produit à la satisfaction de lACIA ou le condamner. Lorsque des analyses ont permis de détecter la présence d'E. coli O157:H7 dans un produit, linspecteur responsable déterminera les activités de réévaluation nécessaires et avisera le chef, Réseau de programmes (Produits dorigine animale), qui informera à son tour linspecteur responsable de létablissement expéditeur. Si le produit a été importé, le Centre opérationnel avisera immédiatement par écrit le chef, Programmes dimportations, Division des aliments dorigine animale, à Ottawa. Le chef, Programmes dimportations, informera les autorités du pays exportateur pour quune enquête plus poussée soit entreprise. En résumé, il existe trois possibilités : a) Lorsquun résultat présomptif ou positif est obtenu à la suite des analyses de validation ou de vérification des produits de létablissement, lexploitant doit considérer ces résultats comme une preuve que son système HACCP ne permet pas dobtenir un produit dont le taux d'E. coli O157:H7 soit en deçà du seuil de détection. Par conséquent, lexploitant doit aviser immédiatement linspecteur responsable et prendre des actions correctives immédiates, y compris continuer de retenir le produit pour empêcher son utilisation, décider du sort qui doit lui être réservé (cuisson complète ou condamné et dénaturé) et réévaluer son système HACCP afin de déterminer la raison des écarts et les étapes nécessaires pour empêcher quils ne se reproduisent. Il doit envisager sérieusement daméliorer les étapes du système HACCP de façon à éliminer plus efficacement le pathogène. Après la mise en uvre des changements, lexploitant doit valider de nouveau le système en prélevant le nombre requis déchantillons pendant un mois complet de production (c.-à-d. étape 3 de la validation, voir le paragraphe 8). LACIA vérifiera le plus tôt possible lefficacité des actions correctives et préventives mises de lavant par lexploitant au moyen dun audit de système ou dune autre activité d inspection (lorsque létablissement nest pas reconnu par le PASA) et dun examen des données de validation. Les éléments applicables du système HACCP seront ciblés au cours de laudit. b) Lorsquun résultat présomptif positif est obtenu à la suite des analyses de vérification effectuées sur des produits reçus par un établissement spécifique, lexploitant doit aviser immédiatement linspecteur responsable et prendre des actions correctives immédiates, y compris continuer de retenir le produit afin dempêcher son utilisation et décider du sort qui doit lui être réservé (cuisson complète, condamné et dénaturé ou retour au fournisseur sous scellé gouvernemental). De plus, lexploitant doit communiquer avec létablissement expéditeur pour linformer des résultats des analyses. Létablissement expéditeur doit considérer cet avis comme une preuve que son système HACCP ne permet pas dobtenir un produit dont le taux d'E. coli O157:H7 est en deçà du seuil de détection. (Voir le paragraphe précédent pour connaître les mesures que doivent prendre lexploitant de létablissement expéditeur et lACIA.) c) Lorsque le produit trouvé positif (ou présomptif positif ) à E. coli O157:H7 contient du matériel en provenance de divers établissements et quil est impossible de déterminer la source exacte de la contamination (p.ex. analyse de produits finis), lexploitant doit aviser immédiatement linspecteur responsable et prendre des actions correctives immédiates, y compris continuer de retenir le produit afin dempêcher son utilisation et décider du sort qui doit lui être réservé (cuisson complète ou condamné et dénaturé). De plus, lexploitant doit informer tous les fournisseurs que leur produit était peut-être contaminé. Cette notification vise à sassurer que les établissements expéditeurs savent quils pourraient être à lorigine de la contamination par E. coli O157:H7. Chacun des fournisseurs doit examiner son système HACCP pour les lots en cause afin de vérifier si des données indiquent que le système na pas été mis en uvre de façon adéquate. Par la suite, ils décideront si les résultats justifient la réévaluation du système HACCP et la prise dactions correctives et préventives adéquates. LACIA évaluera les décisions des établissements à cet égard. Selon les circonstances, les choix du sort réservé au produit, qui doivent être faits avec lautorisation de lACIA et sous sa supervision, sont les suivants :
14. LACIA effectuera un examen systématique (voir lannexe 1 -E. coli O157:H7 diagramme de révision de la réévaluation) des données de réévaluation de lexploitant pour déterminer si les mesures prises pour satisfaire à la présente politique sont acceptables et efficaces. Dans le cadre de ce processus, linspecteur responsable de lACIA complètera la grille de révision (voir lannexe 2 - Grille de révision de la réévaluation en présence d'E. coli O157:H7 des établissements) et confirmera que les renseignements fournis par lexploitant (p.ex. coordonnateur HACCP) sont complets et correspondent à la situation réelle au sein de létablissement. Si des lacunes sont identifiées, lexploitant en sera informé par écrit par le coordonnateur PASA et devra déterminer et mettre en uvre les actions correctives adéquates et fournir une réévaluation révisée dans les trente jours civils suivant lémission de la lettre. Puisquil est nécessaire de recueillir des données de validation pendant une période dépassant les trente jours pour la nouvelle réévaluation, le chef du Réseau de programmes, aliments dorigine animale, du Centre opérationnel pourra accorder un délai supplémentaire après avoir évalué le protocole de validation de létablissement. Un rapport de suivi doit être transmis chaque mois par le chef du Réseau de programmes, aliments dorigine animale, au gestionnaire national, Programme des viandes. Ce rapport devrait viser tous les établissements supervisés par le Centre opérationnel qui manipulent du boeuf cru et indiquer les résultats de leur réévaluation (voir lannexe 3). Les exploitants qui ne se soumettront pas à ces exigences perdront leur privilège dexporter aux États-Unis et, sils sont reconnus par le PASA, des étapes seront entreprises pour leur retirer la reconnaissance du PASA selon les procédures établies du programme. Dans le cadre dune approche axée sur le risque et pour réduire le risque pour les consommateurs, le quartier général de lACIA pourrait aussi augmenter le nombre déchantillons à prélever et à analyser pour la détection d'E. coli O157:H7 dans les établissements qui ne se seront pas pliés à ces exigences. La cote de létablissement pourra également être abaissée en conséquence. Annexe 1: Diagramme de révision de la réévaluation en présence dE. coli O157:H7
Annexe 2 : Grille de révision de la réévaluation des établissements en présence dE. coli O157:H7
Commentaires :
Partie B : À remplir pour chacun des plans HACCP indiqués à la partie A - Q4. Plans HACCP :
Les documents suivants doivent être acheminés au coordonnateur PASA du Centre opérationnel (veuillez inscrire la mention « Confidentiel » sur lenveloppe et les documents) :
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Annexe 3 Rapport détape mensuel sur la réévaluation des
établissements en présence dE. coli O157:H7 Centre
opérationnel :
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Annexe 4 Nombre (n) de carcasses de boeuf à sélectionner pour la validation
des interventions de réduction microbiologique fondée sur le décompte des
entérobactéries (EB)
Protocole déchantillonnage Léchantillonnage devrait être effectué sur une période de quatre mois. Il est recommandé deffectuer léchantillonnage durant les saisons où le taux de prévalence est le plus élevé. Les carcasses doivent être choisies au hasard tout au long de la période de validation. Il faut déterminer davance les jours et les heures de façon à créer un plan déchantillonnage. Au moment du prélèvement, il faut choisir les carcasses à laveugle (p.ex. la 5e carcasse suivant une carcasse précise choisie expressément). Le prélèvement devrait se faire du côté A (droit ou gauche) pour lévaluation des EB avant lintervention prévue. Après lintervention, le prélèvement devrait se faire du côté B (gauche ou droit) de la même carcasse. Pour la carcasse suivante choisie selon le plan déchantillonnage, le prélèvement devrait dabord se faire du côté B (avant), puis du côté A (après). En principe, pour lévaluation des EB avant lintervention prévue, il faut alterner entre les côtés A et B des carcasses choisies selon le plan déchantillonnage. Évaluation statistique Pour évaluer lefficacité de réduction de lintervention au-delà du hasard, on recommande davoir recours au test dégalité des espérances : observations pairées (T-test). Ce test est offert dans Excel (macro complémentaire) dans Outils/Utilitaire danalyse/Test dégalité des espérances : observations pairées. La plage pour la variable 1 devrait correspondre aux numérations des EB obtenues avant lintervention. La plage pour la variable 2 devrait correspondre aux numérations des EB obtenues après lintervention. La différence entre les moyennes (hypothèse) devrait être fixée à 0 et le seuil de signification (niveau alpha), à 0,05. Les interventions réussies devraient produire une valeur p inférieure à 0,05. Tableau 1 : Taille de léchantillon nécessaire pour obtenir un seuil en deçà de 1 %, de 0,5 % ou de 0,1 % de E. coli O157:H7 durant 1 mois avec un niveau de confiance à 95 %
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Annexe 5 USDA Chapitre nouveau, révisé ou archivé : MLG 5.03 Titre : Detection, Isolation, and Identification of Escherichia coli O157:H7 and O157:NM (Nonmotile) from Meat Products (Détection, isolement et identification de souches dEscherichia coli O157:H7 et O157:NM (non mobile) dans les produits de viande) Date dentrée en vigueur : Le 25 octobre 2002 Description et objet des modifications : Les chapitres du Microbiology Laboratory Guidebook consacrés aux méthodes sont actuellement en cours de révision. Le formatage sera modifié afin de répondre aux exigences du système de contrôle des documents du laboratoire. Dautres éléments seront ajoutés au contenu, p. ex. la section 5.1.2 : Limites de détection, pour satisfaire aux exigences ISO 17025. Des Mesures de sécurité ont également été insérées dans les chapitres révisés. Apprové: B. Cottingham, 4/18/02 Apprové: Phyllis Sparling, 10/17/02 Grandes lignes de la méthode 5.1 Introduction 5.1.1 Généralités 5.1.2 Limites de détection 5.2 Sécurité 5.3 Mesures de contrôle de la qualité 5.4 Équipement, matériel, milieux de culture, réactifs et trousses danalyse 5.4.1 Équipement 5.4.2 Milieux de culture, réactifs et cultures 5.4.3 Trousses danalyse 5.5 Méthode de détection 5.6 Méthode disolement 5.7 Identification et confirmation 5.8 Conservation des cultures 5.9 Références 5.1 Introduction 5.1.1 Généralités La méthode décrite ci-dessous est utilisée pour détecter la présence de Escherichia coli O157:H7 et O157:NM (O157:H7/NM) dans les produits de viande crus et prêts-à-manger. La méthode est fondée sur lenrichissement dans un milieu de culture liquide sélectif, un test de dépistage rapide, la séparation immunomagnétique (SIM) sur des colonnes paramagnétiques et létalement sur gélose hautement sélective. Les résultats sont exprimés en fonction des définitions qui suivent. Un échantillon potentiellement positif provoque une réaction positive au test de dépistage (trousse). Un échantillon présumé positif donne des colonies caractéristiques sur gélose Rainbow et réagit de manière spécifique avec lantisérum O157. Le terme déchantillon positif confirmé pour E. coli O157:H7 ou E. coli O157:NM sapplique à un échantillon pour lequel des épreuves biochimiques et sérologiques confirment lidentité de lisolat, et dans lequel on a mis en évidence la présence de toxine(s) de Shiga ou de gène(s) codant cette toxine. À moins dindication contraire, toutes les mesures mentionnées dans la présente méthode ont une tolérance de ± 2 %. 5.1.2 Limites de détection Ce test fiable permet de détecter moins de 1 CFU/g (CFU = unité formatrice de colonie) dans un échantillon de 65 g. 5.2 Sécurité La souche E. coli O157:H7/NM est pathogène pour les humains et sa dose infectieuse est faible. (Lingestion de 100 cellules bactériennes peut suffire à causer la maladie.) Le port de gants et dune protection pour les yeux est obligatoire, et toutes les surfaces de travail doivent être désinfectées avant et immédiatement après les manipulations. Le personnel de laboratoire doit se conformer aux lignes directrices des CDC (Centers for Disease Control) relatives à la manipulation dagents pathogènes de la classe de biosécurité II. Une enceinte de biosécurité à flux laminaire de classe II est recommandée pour les manipulations dagents pathogènes risquant de produire des aérosols. On devrait veiller à obtenir des fabricants et des distributeurs toutes les fiches signalétiques (FS) disponibles sur les milieux de culture, les produits chimiques, les réactifs et les microorganismes utilisés dans les analyses. Le personnel appelé à manipuler ces produits doit lire toutes les FS pertinentes. 5.3 Mesures de contrôle de la qualité a. Les géloses Rainbow® ont une durée de conservation de 2 semaines. b. Tous les milieux de culture et le tampon E doivent être préchauffés à 18-35 C avant lutilisation. c. La souche fluorescente de E. coli O157:H7 recommandée doit être utilisée dans la présente méthode pour détecter la présence de contamination croisée. Le protocole pour lutilisation des souches fluorescentes de E. coli O157:H7 comme témoins positifs est le suivant : Les souches sauvages de E. coli O157:H7 transformées avec le pGFP produisent une protéine verte fluorescente. Grâce à cette transformation, les souches fluorescentes de E. coli O157:H7 possèdent la propriété unique démettre une fluorescence vert clair visible dans lobscurité lorsquelles sont éclairées au moyen dune lumière UV de grande longueur donde. Cette propriété, qui les distingue des souches typiques de E. coli O157:H7, en fait des témoins positifs utiles pour détecter la présence de E. coli O157:H7/NM dans les échantillons de viande. À différentes étapes de la méthode, on vérifiera la présence de fluorescence vert clair dans les échantillons et chez les témoins positifs (fluorescents), ce qui constitue une mesure de contrôle de la qualité permettant dassurer que les isolats déchantillons positifs proviennent vraiment de léchantillon et non dune contamination accidentelle par les témoins positifs. Les résultats des études effectuées au laboratoire des microorganismes pathogènes du FSIS (Food Safety and Inspection Service) de Beltsville, aux États-Unis, ont montré que ces cultures fluorescentes peuvent être soumises aux techniques disolement et didentification de E. coli O157:H7/NM sans perdre leur capacité de fluorescence. Ces souches conservent leurs propriétés de fluorescence lorsquelles sont cultivées dans un milieu SOB addtionné dampicilline (SOB + A). Tous les 7 jours, elles doivent être repiquées dans du milieu SOB + A frais, tel quindiqué ci-dessous. Les colonies fluorescentes peuvent être utilisées comme témoins positifs dès le jour 3 du protocole décrit ci-après, et pendant les 6 jours suivants, sans perdre leurs propriétés de fluorescence. Les cultures peuvent également être conservées pendant 1 mois au réfrigérateur sur des géloses SOB + A placées dans des sacs « zip-lock » ou dans des boîtes de Petri scellées avec du Parafilm®. Lorsquon en a besoin, il suffit densemencer un bouillon SOB + A frais, 2 jours avant lutilisation. Il est essentiel de suivre le protocole suivant à la lettre pour assurer que les souches fluorescentes ne perdent pas leur capacité démettre la fluorescence verte. i. Vérifier la fluorescence de la souche E. coli O157:H7 (souche nunéro EC 465-97 du FSIS ou la souche témoin désignée) sur gélose SOB + A en éclairant les colonies au moyen dune lampe UV à grande longueur donde, dans lobscurité. ii. Ne choisir que des colonies fluorescentes pour ensemencer des tubes contenant 10 mL de bouillon SOB + A. Incuber les tubes à 35 ± 2 C pendant la nuit. iii. À partir des cultures en bouillon, ensemencer en stries des géloses SOB + A. Incuber les boîtes de Petri à 35 ± 2 C pendant la nuit. iv. Vérifier la fluorescence des colonies. À cette étape, on peut utiliser les colonies fluorescentes pour ensemencer du bouillon EC modifié et additionné de novobiocine (mEC+n). Ces cultures sur gélose SOB + A peuvent être conservées au réfrigérateur et utilisées comme témoins positifs pendant 6 jours encore. Incuber les bouillons mEC+n ensemencés au moyen des témoins positifs à 35 ± 2 C pendant la nuit avec les échantillons à vérifier. v. Passer aux sections 5.5 et 5.7 pour poursuivre lanalyse et vérifier la fluorescence des témoins positifs et des cultures déchantillons positifs sur gélose au sang. 5.4 Équipement, matériel, milieux de culture, réactifs et trousses danalyse 5.4.1 Équipement a. Balance, précision 0,1 g b. Homogénéisateur StomacherMC400 ou 3500 et sacs StomacherMCstériles de capacité appropriée, avec ou sans sac-tamis interne (Tekmar Co., Cincinnati, Ohio) ou léquivalent c. Étuve, 35 ± 2 C d. Micropipettes pour des volumes de 15 à 1000 µL, et embouts stériles jetables munis de filtres e. Pipetteur et pipettes stériles de 1,0 mL, 5,0 mL et 10,0 mL f. Anses à inoculer, étaloirs et aiguilles g. Lampe UV (à grande longueur donde, exemple VWR 36553-124 ou léquivalent) h. Unité de filtration stérile, filtre en nylon 0,2 µm i. Thermomètre à infrarouge j. Agitateur LabQuakeMC(ou léquivalent) avec pinces pour tenir les microtubes à centrifugation k. Tubes en polypropylène (12 x 75 mm), stériles, jetables (exemple Fisher numéro 14-956-1B ou léquivalent) l. Microcentrifugeuse et tubes à microcentrifugation stériles de 1,5 mL m. Tubes coniques stériles de 50 mL (exemple Falcon® numéro 2070 ou léquivalent) ou bouteilles stériles n. Tamis pour suspension cellulaire, stérile (Falcon® numéro 2340 ou léquivalent) o. Colonnes de séparation MACS® pour grosses cellules (Miltenyi Biotec numéro 422-02 ou léquivalent) p. Aimant de séparation OctoMACS® (Miltenyi Biotec numéro 421-09 ou léquivalent) q. Support pour laimant de séparation OctoMACS® (Miltenyi Biotec numéro 423-03 ou léquivalent) r. Plateau autoclavable, environ 130 mm x 83 mm (exemple VWR numéro 6266-222 ou léquivalent) pour utilisation avec laimant OctoMACS® 5.4.2 Milieux de culture, réactifs et cultures a. Bouillon EC modifié additionné de novobiocine (mEC+n) ou léquivalent b. Gélose Rainbow® O157 (Biolog Inc., Hayward, Californie, 94545) contenant 10 mg/L de novobiocine et 0,8 mg/L de tellurite de potassium, ou un milieu sélectif équivalent c. Gélose trypticase-soja additionnée de 5 % de sang de mouton d. Milieu SOB + A e. Tampon E, environ 7 mL par échantillon (eau peptonée tamponnée, albumine bovine Sigma numéro 7906 [ou léquivalent] et Tween-20® ou léquivalent) f. Désinfectant (Lysol® CI 20 % ou léquivalent) g. Billes Dynal®, numéro 710.04, paramagnétiques recouvertes danticorps anti-E. coli O157 (Dynal Inc., Lake Success, New York 11042) ou léquivalent h. Souche E. coli O157:H7 numéro 465-97 (témoin positif utilisé dans la méthode) i. Souche E. coli numéro 25922 de lATCC (témoin négatif pour les tests de dépistage et de captation par les billes) 5.4.3 Trousses danalyse a. Le test de dépistage de la présence de E. coli O157:H7/NM doit satisfaire ou dépasser les exigences suivantes : Sensibilité: plus grand ou égal 98 % Spécificité: plus grand ou égal 90 % Taux de faux négatifs: plus pétit ou égal 2 % Taux de faux positifs: plus pétit ou égal 10 % b. Trousse de vérification de lagglutination au latex pour E. coli O157:H7 (RIM® E. coli O157:H7, REMEL, 12076 Santa Fe Drive, Lenexa, Kansas 66215, ou léquivalent) c. Trousses et systèmes danalyses biochimiques (cartes GNI et GNI Plus, Vitek® [bioMerieux Vitek Inc., 595 Anglum Drive, Hazelwood, Missouri 63042-2395] ou léquivalent) d. Trousse de détection de la toxine de Shiga (Premier® EHEC, number 608096 [Meridian Diagnostics Incorporated, 3471 River Hills Drive, Cincinnati, Ohio, 45244]) ou léquivalent 5.5 Méthode de détection a. Préparation de léchantillon i. Analyses microbiologiques des échantillons de boeuf haché cru. Prélever au hasard cinq sous-échantillons de 65 ± 2 g (total de 325 ± 10 g) représentatifs de léchantillon entier. Mettre chaque sous-échantillon de 65 ± 2 g dans un sac StomacherMCstérile muni dun sac-tamis interne. Ajouter 585 mL de bouillon mEC+n et homogénéiser pendant 2 minutes au moyen de lappareil StomacherMC. ii. Galettes de viande cuite et saucissons fermentés secs ou demi-secs. Préparer au hasard cinq sous-échantillons de 65 ± 2 g (total de 325 ± 10 g) représentatifs de léchantillon entier. Lorsque approprié, prélever des échantillons représentatifs de la surface extérieure et de la portion intérieure de produits prêts-à-manger, particulièrement les saucissons fermentés secs et demi-secs. Mettre chaque sous-échantillon de 65 ± 2 g dans un sac Stomacher® stérile. Ajouter 585 mL de bouillon mEC+n et homogénéiser pendant 2 minutes au moyen de lappareil StomacherMC. iii Échantillons associés à des éclosions. Prélever au hasard treize sous-échantillons de 25 ± 1 g (total de 325 ± 10 g) représentatifs de léchantillon entier. Mettre chaque sous-échantillon de 25 ± 1 g dans un sac StomacherMCstérile muni dun sac-tamis interne, puis ajouter 225 mL de bouillon mEC+n. Homogénéiser pendant 2 minutes au moyen de lappareil StomacherMC. b. Incuber tous les sacs (sans agitation) à 35 ± 2 C, pendant 20 à 24 h. Inclure des témoins positif et négatif, ainsi quun témoin de milieu de culture non ensemencé pour chaque group déchantillons vérifiés. Utiliser la souche fluorescente E. coli O157:H7 (numéro EC 465-97 du FSIS) comme témoin positif et la souche E. coli ATCC numéro 25922 comme témoin négatif. c. Utiliser les cultures denrichissement en sac Stomacher® pour faire le test de dépistage de E. coli O157:H7/NM selon les instructions du fabricant. La culture denrichissement peut être analysée immédiatement après lincubation sans quil soit nécessaire dattendre quelle refroidisse et atteigne la température ambiante. Pour éviter que les embouts de pipette ne sobstruent, sassurer de prélever le volume approprié déchantillon à partir du bouillon de culture se trouvant à lextérieur du sac-tamis interne. d. Noter les échantillons négatifs au test de dépistage, puis sen débarrasser. e. Noter les échantillons positifs au test de dépistage comme des échantillons potentiellement positifs. Commencer la technique disolement à partir des cultures denrichissement en sac StomacherMC. 5.6 Méthode disolement Note : Les étapes « a à l » peuvent être effectuées dans lordre qui convient le mieux au personnel de laboratoire. a. Préparer le tampon E en mélangeant 0,5 g dalbumine bovine et 50 µL de Tween-20® dans 100 mL deau peptonée tamponnée. Stériliser par filtration (0,2 µm) et conserver à 2-8 C. b. Sortir les géloses Rainbow® du réfrigérateur (2-8 C); prévoir 3 boîtes de Petri pour chaque culture positive au test de dépistage et chaque témoin. Sassurer que les géloses ne présentent aucun signe dhumidité à la surface au moment de lutilisation. Au besoin, les sécher (p. ex. jusquà 30 minutes sous une hotte à flux laminaire, les couvercles enlevés) avant lutilisation. Inscrire « séchées » sur les boîtes de géloses séchées non utilisées, les placer dans un sac et les remettre à 2-8 C. c. Sortir une bouteille de tampon E du réfrigérateur (2-8 C). Pour chaque culture et chaque témoin, verser 7 mL de tampon E dans un tube ou une bouteille stériles, et laisser réchauffer jusquà 18 C, au moins. (Remettre la solution-mère de tampon E à 2-8 C.) d. Pour chaque témoin positif et négatif, ainsi que chaque culture ayant donné un résultat positif au test de dépistage, étiqueter des tubes à centrifugation coniques de 50 mL et les placer dans lordre suivant : dabord le témoin positif, puis le témoin négatif suivi de toutes les cultures à vérifier. Conserver cet ordre pour les étapes subséquentes. e. Pour chaque témoin positif et négatif, et chaque culture ayant donné un résultat positif au test de dépistage, étiqueter deux microtubes à centrifugation stériles de 1,5 mL (pour les étapes « g » et « s »), un tube à centrifugation conique de 50 mL (pour létape « h ») et deux tubes de 12 x 75 mm munis dun bouchon (lun de ces tubes servira pour létape « p »). Étiqueter lun des tubes de 12 x 75 mm et y verser 0,9 mL de tampon E (pour létape « q »). f. Préparer la suspension de billes immunomagnétiques Dynal numéro 710.04 E. coli O157:H7 selon les indications du tableau 1 ci-dessous. Sassurer dinclure les témoins positif et négatif dans le nombre total de cultures à vérifier. Utiliser la suspension de billes immédiatement (étape « g »), ou la conserver à 2-8 C. Remettre la suspension-mère de billes immunomagnétiques Dynal numéro 710.04 E. coli O157:H7 à 2-8 C. g. Vortexer brièvement la suspension de billes (2-3 secondes), puis en distribuer des aliquotes de 50 µL dans les microtubes à centrifugation étiquetés à létape « e » (soit un tube pour chacun des témoins et chacune des cultures ayant donné un résultat positif au test de dépistage). Utiliser immédiatement ou conserver à 2-8 C. h. lacer un tamis pour suspension cellulaire de 40 µm sur un tube à centrifugation conique de 50 mL étiqueté à létape « e ». Pipetter 5 ± 1 mL de chaque témoin et culture denrichissement, et déposer les suspensions sur les tamis appropriés. Recueillir au moins 1,0 mL de filtrat. i. Ne pas utiliser plus de tubes que ne peut en contenir un aimant OctoMACS®. Transférer 1,0 mL de filtrat (étape «h ») dans le microtube à centrifugation correspondant contenant la suspension de billes immunomagnétiques (étape « g ») et placer les microtubes dans les pinces de lagitateur-rotateur de tubes LabQuake®. Mélanger par rotation pendant 10-15 minutes à 18-30 C. j. Fixer laimant OctoMACS® au support. k. Placer un plateau sur la base du support afin dy recueillir les filtrats après leur passage sur colonne. Ajouter suffisamment de désinfectant Lysol® à CI de 2 % (ou léquivalent) pour recouvrir le fond du plateau (environ 300 mL). l. Étiqueter le nombre approprié de colonnes pour la séparation de grosses cellules et les placer sur laimant OctoMacs®. Insérer les colonnes par lavant en veillant à ce que la pointe ne touche aucune surface. Laisser les pistons dans les sacs afin den maintenir la stérilité. m. Déposer au moins 0,5 mL de tampon E sur chaque colonne et laisser passer le volume sur la colonne. n. Remettre les cultures en suspension, puis déposer chaque témoin et chaque culture (de létape « i ») sur la colonne appropriée. o. Une fois les cultures passées sur les colonnes, laver ces dernières avec 1,0 mL de tampon E. Laisser couler le tampon. Répéter 3 fois pour un total de 4 lavages. p. Après le dernier lavage, enlever les colonnes de laimant OctoMACS®. Insérer la pointe dune colonne dans un tube vide de 12 x 75 mm étiqueté à létape « e ». Déposer 1,0 mL de tampon E sur la colonne, et à laide du piston fourni avec la colonne, expulser immédiatement les billes dans le tube. Faire glisser le piston de manière continue pour éviter les éclaboussures. Boucher les tubes. Répéter pour chaque colonne. Avant de réutiliser laimant OctoMACS® pour une deuxième série de cultures, le décontaminer en suivant la méthode décrite à létape « u » ci-dessous. Répéter les étapes « j à s » pour les autres cultures. q. Vortexer brièvement les tubes de létape « p » pour remettre les billes en suspension. Préparer une dilution 1:10 de chaque suspension de billes traitées en ajoutant 0,1 mL de la suspension à 0,9 mL de tampon E contenu dans un tube de 12 x 75 mm préparé à létape « e ». r. Vortexer brièvement pour maintenir les billes en suspension, puis étaler 0,1 mL de chaque tube (étapes « p et q ») sur une gélose Rainbow®. Utiliser un étaloir pour bien étaler les billes et veiller à ne pas les étaler contre les parois du Petri. s. Vortexer les tubes contenant la suspension de billes non diluée (étape « p ») et transférer celle-ci dans un microtube à centrifugation de 1,5 mL étiqueté à létape « e ». Centrifuger pendant au moins 1 minute dans une microcentrifugeuse de table pour sédimenter les billes. Retirer et éliminer le surnageant sans déranger les billes. Ajouter 1,0 mL de tampon E aux billes, les remettre en suspension et les étaler sur une gélose Rainbow®, tel quindiqué à létape «r ». t. Dès quil ny a plus de trace dhumidité à la surface de la gélose, inverser les boîtes de Petri et les incuber à 35 ± 2 C pendant 24-26 h. u. Pour décontaminer laimant OctoMACS®, verser une solution de Lysol® à CI de 2 % directement sur laimant. Laisser agir la solution pendant une dizaine de minutes, puis rincer avec de leau désionisée ou de leau du robinet. Laisser sécher laimant à lair ou lessuyer avec du papier essuie-tout. TABLEAU 1
5.7 Identification et confirmation a. Après lincubation, les colonies de E. coli O157:H7 sont de couleur noire ou grise sur gélose Rainbow®. Lorsque les colonies de E. coli O157:H7 sont entourées de colonies roses ou magenta, elles peuvent présenter une teinte bleutée. Marquer les colonies caractéristiques de E. coli O157:H7, puis procéder aux tests dagglutination au latex pour O157 en suivant les instructions du fabricant. Ensemencer en stries des géloses au sang avec toutes les colonies ayant présenté un test positif dagglutination au latex jusquà un maximum de 5 colonies par échantillon (une colonie par sous-échantillon, si possible). Incuber les boîtes de Petri à 35 ± 2 C pendant 16 à 24 h. Note : Sil ny a aucune colonie caractéristique de E. coli O157:H7 sur les géloses Rainbow®, laisser les boîtes de Petri à 20-24 C pendant 6 à 24 h de plus, puis les examiner de nouveau. b. Après lincubation, vérifier la pureté des cultures sur les géloses au sang à la lumière visible, puis vérifier la présence de contamination croisée par le témoin positif à la lumière UV de grande longueur donde. Seul le témoin positif, la souche 465-97 de E. coli O157:H7 devrait émettre de la fluorescence. Si les cultures sur les géloses au sang semblent pures et non contaminées, procéder aux épreuves de confirmation suivantes. i. Confirmation biochimique Ensemencer des cartes GNI ou GNI Plus, Vitek®, ou utiliser un système équivalent dépreuves didentification. Lépreuve de la cytochrome oxydase et la coloration de Gram sont facultatives. ii. Confirmation sérologique Pour confirmer labsence ou la présence des antigènes O157 et H7, utiliser une trousse dagglutination au latex pour E. coli O157:H7 (RIM® ou léquivalent) et les cultures sur gélose au sang (de létape « b »). iii. Confirmation de la présence de toxine de Shiga ou de gènes codant celle-ci. La présence de toxine(s) de Shiga dans un isolat doit être confirmée au moyen dune épreuve de détection, p. ex. la trousse Premier® EHEC de Meridian ou léquivalent. Lorsque aucune toxine de Shiga nest détectée, recourir à la PCR pour confirmer la présence dau moins un gène codant une toxine de Shiga. Le témoin positif E. coli O157:H7 ne produit pas de toxine. c. Si les tests confirment quil sagit de E. coli O157:H7 ou de E. coli O157:NM (ou encore une souche O157 à lantigène H indéterminé) et que la ou les toxines de Shiga et/ou un ou des gènes codant ces toxines sont détectés, léchantillon sera considéré comme positif pour E. coli O157:H7, et des mesures réglementaires seront prises. On vérifiera également la possibilité dassociation épidémiologique entre les cultures au moyen de lélectrophorèse sur gel en champs pulsés. 5.8 Conservation des cultures Pour les exigences relatives à la conservation de la souche fluorescente E. coli O157:H7 (numéro EC 465-97 du FSIS ou la souche témoin désignée), consulter la section 5.3.c du présent chapitre. Conserver les cultures « de travail » de E. coli sur des géloses nutritives en pente. Repiquer les cultures une fois par mois, en duplicata, sur des géloses nutritives en pente, les incuber à 35 ± 1 C pendant la nuit, puis les conserver à 4-8 C. Utiliser lune des géloses en pente comme culture de travail et lautre pour le repiquage afin de réduire le risque de contamination. Les cultures peuvent être repiquées jusquà 5 fois. Ensuite, il faut confirmer leur identité de nouveau au moyen dépreuves biochimiques ou partir une nouvelle culture. Pour conserver les cultures pendant de longues périodes, les congeler au moyen de billes de congélation, p. ex. CryoStorMC, ou les lyophiliser. 5.9 Références Ewing, W. H. 1986. Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriaceae, 4th Edition. Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York. Fratamico, P. M., M. Y. Deng, T. P. Strobaugh, and S. A. Palumbo. 1997. Construction and characterization of Escherichia coli 0157:H7 strains expressing firefly luciferase and green fluorescent protein and their use in survival studies. J. Food Proto 60: 1167 -1173. Harrison, B. and D. Warburton. 1997. Identification of Escherichia coli verotoxins by the Meridian Premier EHEC kit®. Laboratory procedure MFLP-93 In The Compendium of Analytical Methods, Vol. 3. Health Protection Branch, Health Canada, Ottawa, Canada. Hitchins, A. D., P. Feng, W. D. Watkins, S. R. Rippey, and L. A. Chandler. 1995. Escherichia coli and the coliform bacteria. Chapter 4 In FDA Bacteriological Analytical Manual, 8th ed., p. 4.23. AOAC International, Gaithersburg, Maryland. Hitchins, A. D., P. A. Hartman, and E. C. D. Todd. 1992. Coliforms-Escherichia coli and its toxins, p. 325-369. In C. Vanderzant and D. F. Splittstoesser (ed.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 3rd Edition. American Public Health Association, Washington, District of Columbia 20005. Okrend, A. J. G., B. E. Rose, and B. Bennett. 1990a. A research note: A screening method for the isolation of Escherichia coli 0157:H7 from ground beef. J. Food Prot. 53:249-252. Park, C. H., K. M. Gates, N. M. Vandl, and D. L. Hixon. 1996. Isolation of Shiga-like toxin producing Escherichia coli (0157 and non-OI57) in a community hospital. Diagnostic Microbiological Infectious Disease 26:69-72. Richmond, J. Y. and R. W. McKinney (ed.). 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4th ed. 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