Procédure de laboratoire MFLP-74
Avril 2002 (Version PDF)
DÉNOMBREMENT DE LISTERIA MONOCYTOGENES DANS LES ALIMENTS
Franco Pagotto, Elaine Daley et J.M. Farber
Division de la recherche, Bureau de dangers microbiens,
Direction des aliments, Santé Canada,
Ottawa (Ontario)
DGPSA, Repère postal : 2204A2
K1A 0L2
Franco_Pagotto@hc-sc.gc.ca
1. APPLICATION
Cette méthode est applicable au dénombrement des Listeria
monocytogenes viables dans les aliments, y compris certains aliments prêts-à-manger
(fruits de mer, produits laitiers, viandes rouges, volaille et légumes,
etc.) et lorsqu'une détermination semi-quantitative est requise
pour établir la conformité avec les normes publiées
dans la dernière édition du Guide d'application de la réglementation
régionale « Aliments prêts-à-manger contaminés
par L. monocytogenes » (7,2). Cette méthode remplace la méthode
MFLP-74 datée d'avril 1995.
2. PRINCIPE
Cette méthode semi-quantitative permet de déterminer par
ensemencement direct en boîte le nombre de L. monocytogenes viables
présents dans un produit. Sur le plan de l'intervention réglementaire,
la méthode vise à déceler les aliments contenant
d'importantes populations de L. monocytogenes (>100 UFC/g). Toutefois,
s'il faut des mesures plus précises, il est possible d'utiliser
d'autres dilutions qui permettent un dénombrement aussi petit que
1 UFC/g. Un échantillon du produit est mélangé à
un diluant approprié, étalé sur la surface d'aux
moins deux géloses sélectives, lesquelles sont alors incubées
pendant une période déterminée à une température
donnée. On présume que dans ces conditions, chaque cellule
viable de L. monocytogenes se multiplie pour former une colonie visible
que l'on peut identifier. Le choix des milieux sélectifs est fondé
sur les travaux d'autres chercheurs (7.4, 7.6, 7.7).
3. DÉFINITIONS DES TERMES
Voir l'Annexe A du volume 3.
4. PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS
4.1 Voir l'Annexe B du volume 3.
4.2 Au cours du transport, il faut garder toutes les unités d'échantillonnage
réfrigérées (4°C) ou congelées, selon la
nature du produit.
5. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENTS SPÉCIAUX
Voir la section du « Matériel et équipements spéciaux
» de la méthode MFHPB-30.
Voir l'annexe G du Volume 3 pour la composition de chaque milieu.
Autres produits nécessaires :
- Eau peptonée, 0.1 % (p/v)
Facultatif :
- Gélose au chlorure de lithium et à la ceftazidime hémolytique
(HCLA) voir l'Annexe G du volume 3 pour la composition.
- On peut utiliser des géloses chromatogènes et d'autres
nouvelles géloses d'isolement, mais seulement de concert avec les
milieux recommandés. Suivre les instructions du fabricant pour
la préparation et l'utilisation.
6. MARCHE À SUIVRE
On peut connaître la distribution des Listeria spp en analysant
chaque unité analytique séparément. Analyser chaque
unité d'échantillonnage conformément au schéma
d'échantillonnage du Tableau 1.
6.1 Manipulation et dilution des échantillons
6.1.1 Avant l'analyse au laboratoire, sauf dans le cas des aliments
stables à température de la pièce, garder les unités
d'échantillonnage au réfrigérateur (0-5°C) ou au
congélateur, selon la nature du produit. Faire dégeler les
échantillons congelés dans un réfrigérateur,
ou pendant une période et à une température qui empêchent
la croissance ou la mort des micro-organismes.
6.1.2 Analyser les unités d'échantillonnage le plus tôt
possible après leur arrivée au laboratoire.
6.1.3 Pour s'assurer que l'unité d'analyse est vraiment représentative,
agiter les liquides ou les substances fluides jusqu'à ce qu'elles
soient homogènes. Si l'unité d'échantillonnage est
un solide, constituer l'unité d'analyse en prélevant des
portions à plusieurs endroits de l'unité d'échantillonnage.
6.1.4 Si l'on s'attend à trouver de fortes populations de L.
monocytogene, ou encore, pour les besoins de l'intervention réglementaire,
il faut utiliser une partie d'échantillon pour neuf parties de
diluant (1:10).
6.1.5 Facultatif :
S'il faut dénombrer des populations plus faibles, mélanger
une partie d'échantillon avec quatre parties de diluant (1:5).
6.2 Méthode par ensemencement direct
6.2.1 Préparer, dans une jarre de mélangeur ou un sac
de stomacher, une dilution de 1:5 ou de 1:10 de l'échantillon,
selon les besoins, dans de l'eau peptonée à 0,1 % (p/v).
Bien mélanger au mélangeur ou au stomacher.
6.2.2 À partir de la dilution 1:10, prélever immédiatement
une portion de 0,1 ml de l'aliment dilué et l'étaler sur
la surface de deux des quatre milieux sélectifs suivants : LPM,
OXA, MOX, PAL ou gélose chromatogène. Faire en double.
6.2.3 Facultatif :
À partir de la dilution 1:5, prélever immédiatement
une portion de 0,333 ml de l'aliment dilué et l'étaler sur
la surface de deux des quatre milieux sélectifs suivants : LPM,
OXA, MOX, PAL ou gélose chromatogène. Faire en triple.
Note : On peut utiliser des géloses chromatogènes et d'autres
nouvelles géloses d'isolement, mais seulement de concert avec les
milieux recommandés. Suivre les instructions du fabricant pour
la préparation et l'utilisation. La gélose au chlorure de
lithium et à la ceftazidime hémolytique (HCLA) permet de
distinguer les Listeria hémolytiques des Listeria non hémolytiques.
6.2.4 Incuber la gélose LPM à 30°C pendant 24 à 48
h et toutes les autres géloses sélectives à 35°C
pendant 24 à 48 h. Rechercher les colonies ayant une apparence
typique (sections 6.3.1 à 6.3.4).
6.3 Identification présomptive
6.3.1 Gélose LPM Pour repérer les colonies suspectes
sur les géloses LPM, examiner les boîtes à l'aide
d'un faisceau de lumière blanche assez puissant pour bien éclairer
la gélose, orienté à un angle de 45° avec le fond
de la boîte (7.1). Si la transillumination est optimale, les colonies
de Listeria les plus isolées et les plus grosses (âgées
de 48 heures) apparaissent comme des amas blanchâtres de verre pilé
présentant souvent des structures internes en mosaïque et,
parfois, des reflets iridescents bleu-gris qui ont tendance à scintiller.
Les colonies peuvent aussi être lisses et ourlées de bleu.
Lorsque la croissance est presque confluente, on peut observer un reflet
bleu-gris iridescent et homogène.
6.3.2 Géloses OXA et MOX Après 24 heures, L. monocytogenes
forme des colonies noires d'un diamètre de 1 mm entourées
d'un halo noir. Après 48 heures, les colonies ont de 2 à
3 mm de diamètre et sont noires, avec un halo noir et un centre
affaissé. Elles peuvent aussi être brun-noir ou vert-noir.
D'autres espèces de Listeria ont un aspect semblable. Si l'on examine
les boîtes moins de 24 heures après le début de l'incubation,
on peut parfois déceler des colonies de Listeria spp. mais sans
le noircissement caractéristique. Certaines souches de Listeria,
autres que L. monocytogenes, sont inhibées par ce milieu lorsqu'il
est incubé à 35°C.
6.3.3 Gélose PAL Les colonies de L. monocytogenes mesurent
environ 2 mm de diamètre et ont une coloration gris-vert. Elles
présentent un centre noir et affaissé et un halo noir sur
fond rouge cerise. Certaines souches d'Enterococcus et de Staphylococcus
forment des colonies grises entourées d'un halo brun-vert, ou des
colonies jaunes entourées d'un halo jaune.
6.3.4 Gélose HCLA Les colonies ont un aspect semblable
à celui qu'elles ont sur la gélose LPM, sauf que les Listeria
spp. hémolytiques sont entourées d'une étroite zone
d'hémolyse. Les techniques d'éclairage décrites ci-dessus
(voir la section 6.3.1) peuvent servir à distinguer la coloration
bleu-vert des Listeria spp. dans ce milieu (7.1).
6.4 Dénombrement et confirmation des colonies obtenues par ensemencement
direct
6.4.1 Rechercher les colonies typiques dans chaque ensemble de géloses
en double ou en triple de chacun des deux milieux sélectifs utilisés.
Si possible, prélever au moins cinq colonies de chaque ensemble
de géloses.
6.4.2 S'il y a plus de 10 colonies typiques dans un ensemble de géloses
en double ou en triple d'un milieu sélectif, prélever au
total 10 colonies (ou toutes les colonies, s'il y a en a moins de 10)
et les ensemencer en stries sur des géloses TA ou TSA-YE pour la
séparation et la pureté. Incuber les géloses à
30°C pendant 24 h à 48 h ou jusqu'à croissance satisfaisante.
Rechercher les colonies typiques sur les géloses sous l'éclairage
décrit ci-dessus (6.3.1).
6.4.3 Confirmer qu'il s'agit de L. monocytogenes en appliquant la marche
à suivre décrite dans la méthode MFHPB-30 (7.3).
6.5 Interprétation
6.5.1 Dilution 1:10
Si, au total, il y a plus de deux colonies confirmées comme L.
monocytogenes dans l'un des ensembles de géloses en double (p.
ex., deux géloses LPM, deux géloses Oxford), rapporter un
résultat positif, c'est-à-dire >100 UFC/g. Sinon, rapporter
<100 UFC/g comme résultat.
6.5.2 Dilution 1:5
Si au moins une colonie ou plus est confirmée comme L. monocytogenes
dans un ensemble de géloses en triple (p. ex., trois géloses
LPM, trois géloses Oxford), rapporter un résultat positif,
c'est-à-dire >1 UFC/g. Sinon, rapporter <1 UFC/g comme résultat.
6.5.3 Consigner séparément les résultats de chacun
des deux types de milieu sélectif. Cependant, par souci de simplicité
et de commodité, il faudrait rapporter seulement le résultat
le plus élevé. Si l'une des cinq unités d'échantillonnage
est positive, il faudrait rapporter que le lot est positif, c'est-à-dire
>1 UFC/g ou >100 UFC/g.
7. RÉFÉRENCES
7.1 American Public Health Association (APHA). 2001. Compendium of Methods
for the Microbiological Examination of Foods. Quatrième édition.
Chapitre 35. F.P. Downes et K. Ito (éditeurs), American Public
Health Association, Washington, D.C.
7.2 Santé Canada, 1994. Dans : Guide d'application de la réglementation
régionale. Aliments prêts-à-manger contaminés
par Listeria monocytogenes, 1994 (ou édition la plus récente).
7.3 Pagotto, F., E. Daley, J. Farber et D. Warburton. 2001. Isolement
de Listeria monocytogenes dans tous les types d'aliments et les échantillons
environnementaux (MFHPB-30). Compendium de méthodes, volume 2.
http://www.hc-sc.gc.ca/food-aliment .
7.4 Poysky, F.T., R.N. Paranjpye, L.C. Lashbrook, M.E. Peterson, G.A.
Pelroy et M.W. Eklund. 1993. Selective and differential medium for isolation
of Listeria monocytogenes from foods. J. Food Prot. 56:326-329, 332.
7.5 Seeliger, H.P.R. et D. Jones. 1986. Genus Listeria pirie. Dans :
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, vol. 2. (éd.) R.G.E.
Murray. Williams and Wilkins, Baltimore MD. pp. 1235-1245.
7.6 Warburton, D.W., J.M. Farber, A. Armstrong, R. Caldeira, T. Hunt,
S. Messier, R. Plante, N.P. Tiwari et J. Vinet.1991. A comparative study
of the "FDA" and "USDA" methods for the detection
of Listeria monocytogenes in foods. Int. J. Food Microbiol. 13:105-118.
7.7 Warburton, D.W., J.M. Farber, A. Armstrong, R. Caldeira, N.P. Tiwari,
T. Babiuk, P. LaCasse et S. Read. 1991. A Canadian comparative study of
modified versions of the "FDA" and "USDA" methods
for the detection of Listeria monocytogenes. J. Food Prot. 54:669-676.
Tableau 1
Échantillonnage des aliments prêts-à-manger1 (PAM)
pour le dénombrement de L. monocytogenes (LM)
Catégorie d'aliment |
Échantillonnage |
Analyse |
Type d'analyse |
Aliments PAM favorisant la croissance
de LM qui ont une durée de vie sous réfrigération
10 jours, et tous les aliments qui ne permettent pas la croissance2
(p. ex., crème glacée, fromage à pâte dure,
salami sec, poisson séché salé, céréales
pour petit déjeuner et autres produits céréaliers) |
5 unités d'échantillonnage
(100 g ou ml chacun) prélevées au hasard dans le lot.
|
5x10 g unités d'analyse4 sont analysées
séparément.
Lorsqu'il faut faire un enrichissement5, 5x5 g
unités d'analyse4 sont analysées
séparément ou comme composite. |
Ensemencement direct
Enrichissement |
- 1
- Pour une définition des aliments PAM, consulter la dernière
version du Guide d'application de la réglementation régionale
intitulé « Aliments prêts-à-manger contaminés
par Listeria monocytogenes » (7.2).
- 2
- Les aliments qui ne permettent pas la croissance de LM comprennent
ceux qui satisfont aux critères suivants:
- pH de 5,0 à 5,5 et aw < 0,95
- pH < 5,0, peu importe l'aw
- aw 0,92, peu importe le pH
- aliments congelés
Il faudrait mesurer le pH et l'aw de 3 des 5 unités d'analyse.
On considère que l'aliment favorise la croissance de L. monocytogenes
si les mesures de pH et d'aw d'au moins une des unités d'analyse
se situent dans l'échelle de valeurs permettant la croissance de
cet organisme.
- 3
- La liste d'exemples n'est pas exhaustive.
- 4
- Il faut prélever l'unité d'analyse désignée
de chaque unité d'échantillonnage
- 5
- Pour ces aliments, si les BPF sont insuffisantes et qu'on a décelé
L. monocytogenes dans les aires de manutention du produit fini, ou encore
s'il est impossible de faire un examen afin d'établir le niveau
des BPF, on peut utiliser les deux méthodes MFLP-74 et MFHPB-30,
selon les besoins.
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