7.1.1 Eau en contenants scellés

1. Ne pas entreposer les unités d'échantillonnage pendant plus de 24 h avant de procéder à l'analyse. Conserver sous réfrigération ( 0°C à 5°C).

7.1.2 Glace préemballée

1. Si les unités d'échantillonnage sont préemballées dans des contenants étanches, les décongeler dans les contenants d'origine dans un réfrigérateur (0oC-5oC) avant l'analyse.
2. Si les unités d'échantillonnage ne sont pas dans des contenants étanches, transférer la glace aseptiquement dans des sacs de plastique stériles ou autres contenants stériles appropriés. Sceller les contenants pour prévenir la contamination et décongeler les unités d'échantillonnage dans un réfrigérateur (0°C-5°C). Ne pas entreposer les unités d'échantillonnage pendant plus de 6 h avant l'analyse.

7.2.1 Avoir à sa disposition de l'eau peptonée stérile.

7.2.2 Nettoyer la surface de travail au moyen d'un désinfectant approprié.

7.2.3 Placer les éprouvettes de bouillon LST en rangées de cinq et les marquer de façon à identifier l'échantillon et la dilution à ensemencer

.

7.3.1 Ensemencer chacune des séries de cinq éprouvettes de bouillon LST avec chacune des dilutions à analyser selon le schéma suivant :

Ensemencer chacune des 5 éprouvettes de 10 ml de bouillon LST à concentration double (première rangée) avec 10 ml de l'échantillon d'eau non dilué. Ensemencer chacune des 5 éprouvettes de 10 ml de bouillon LST à concentration simple (deuxième rangée) avec 1 ml de l'échantillon d'eau non dilué. Ensemencer chacune des 5 éprouvettes de 10 ml de bouillon LST à concentration simple (troisième rangée) avec 0,1 ml de l'échantillon d'eau non dilué.

7.3.2 Suivre l'incubation du bouillon LST et les étapes de confirmation pour les coliformes, les coliforme fécaux et E. coli, selon les besoins, et consigner les résultats sous forme de NPP par 100 ml d'eau, en suivant les instructions de l'Annexe D.

7.4.1 Afin de vérifier les conditions de croissance dans les bains-marie à haute température, ensemencer le témoin positif des bouillons NPP dans une éprouvette de bouillon LST et le témoin négatif des bouillons NPP dans une éprouvette de bouillon LST pour chaque bain utilisé. Transférer dans tous les milieux utilisés aux différentes étapes de l'analyse. Préparer une éprouvette de milieu non ensemencé correspondant à chaque étape de l'analyse comme le témoin de milieu.

7.4.2 Mélanger doucement l'inoculum et le milieu par agitation ou par rotation, mais éviter d'emprisonner de l'air dans les ampoules de Durham.

7.4.3 Incuber les éprouvettes ensemencées de bouillon LST à 35 C pendant 24 ± 2 h. Vérifier s'il y a eu production de gaz (la production de gaz peut être une bulle de gaz ou de l''effervescence), consigner les résultats et commencer les épreuves requises de confirmation de coliformes, de coliformes fécaux et d'E. coli pour les éprouvettes positives qui contiennent du gaz.

7.4.4 Incuber les éprouvettes qui ne contiennent pas de gaz pendant 24 ± 2 h de plus. Examiner, consigner le nombre d'éprouvettes supplémentaires qui contiennent du gaz, ajouter au résultat obtenu à l'étape 7.4.3 et soumettre les éprouvettes supplémentaires qui contiennent du gaz aux épreuves requises de confirmation de coliformes, de coliformes fécaux et d'E. coli.

7.4.5 S'il n'y a pas eu formation de gaz dans toutes les éprouvettes après 48 ± 4 h d'incubation, l'épreuve de présomption est négative.

7.5.1 Utiliser du bouillon BGLB réparti en volumes de 10 ml dans des éprouvettes contenant des ampoules de Durham.

7.5.2 Mélanger le contenu des éprouvettes de bouillon LST positives, par agitation ou par rotation, et transférer une anse de chaque éprouvette dans une éprouvette de bouillon BGLB (éviter d'entraîner la pellicule). On peut utiliser des bâtonnets en bois stériles ou d'autres dispositifs appropriés pour effectuer les transferts.

7.5.3 Mélanger doucement l'inoculum et le milieu par agitation ou par rotation, mais éviter d'emprisonner de l'air dans les ampoules de Durham.

7.5.4 Incuber les éprouvettes de bouillon BGLB ensemencé à 35 C pendant 24 ± 2 h. Vérifier s'il y a eu production de gaz (bulle de gaz ou effervescence) et consigner les résultats.

7.5.5 Incuber les éprouvettes négatives pendant 24 ± 2 h de plus. Examiner de nouveau, consigner le nombre d'éprouvettes positives supplémentaires et ajouter au résultat obtenu en 7.5.4.

7.5.6 S'il y a eu formation de gaz au cours de la période d'incubation de 48 ± 4 h, l'épreuve de confirmation est positive.

7.5.7 Calculer le NPP de coliformes confirmés par 100 ml d'eau en suivant les instructions de l'Annexe D du volume 1 pour convertir en NPP le nombre d'éprouvettes positives. Consigner les résultats.

7.6.1 Utiliser du bouillon EC (avec ou sans MUG) réparti en volumes de 10 ml dans des éprouvettes contenant des ampoules de Durham.

7.6.2 Mélanger le contenu des éprouvettes positives de bouillon LST (obtenues en 7.4) par agitation ou par rotation et transférer une anse du contenu de chaque éprouvette dans une éprouvette de bouillon EC (éviter d'entraîner la pellicule). On peut utiliser des bâtonnets en bois stériles ou d'autres dispositifs appropriés pour effectuer les transferts. Ce transfert doit se faire en même temps que l'étape 7.5 ci-dessus.

7.6.3 Mélanger doucement l'inoculum et le milieu par agitation ou par rotation, mais éviter d'emprisonner de l'air dans les ampoules de Durham.

7.6.4 Incuber les éprouvettes de bouillon EC ensemencées dans un bain-marie à 45 C pendant 24 ± 2 h. Maintenir le niveau de l'eau dans le bain-marie à au moins 1 cm au-dessus du niveau du milieu contenu dans les éprouvettes.

7.6.5 Examiner pour déterminer s'il y a eu production de gaz (bulle de gaz ou effervescence), consigner les résultats et soumettre toutes les éprouvettes positives à l'épreuve d'identification d'E. coli le jour même (7.7).

7.6.6 Incuber les éprouvettes négatives pendant 24 ± 2 h de plus. Examiner, consigner le nombre d'éprouvettes positives supplémentaires, ajouter aux résultats obtenus à l'étape 7.6.5 et entreprendre l'épreuve d'identification d'E. coli pour les éprouvettes positives supplémentaires.

7.6.7 S'il n'y a pas eu formation de gaz dans toutes les éprouvettes après 48 ± 4 h d'incubation, l'épreuve de présomption est négative.

7.6.8 La production de gaz pendant les 48 ± 4 h d'incubation constitue un résultat positif à l'épreuve de détermination des coliformes fécaux.

7.6.9 Il faut aussi examiner les éprouvettes contenant le bouillon EC-MUG à la lumière UV (366 nm) pour y déceler l'activité de la glucuronidase. Une fluorescence bleu-vert indique une épreuve présomptive positive d'E. coli. Ces éprouvettes peuvent servir aux épreuves décrites en 7.7, qui visent à confirmer la présence d'E. coli.

7.6.10 Calculer le NPP de coliformes fécaux par 100 ml d'eau en suivant les instructions de l'Annexe D pour convertir en NPP le nombre d'éprouvettes positives. Consigner les résultats.

7.7.1 Agiter doucement chacune des éprouvettes positives de bouillon EC contenant du gaz ou chacune des éprouvettes de bouillon EC-MUG fluorescent (7.6.5 et 7.6.6) et ensemencer en stries une anse de la culture sur une boîte de gélose L-EMB ou Endo.

7.7.2 Incuber les boîtes de gélose à 35 °C pendant 18 à 24 h et les examiner afin de déceler la présence de colonies non mucoïdes, nucléées, dont le centre est sombre, avec ou sans reflets métalliques, lesquelles indiquent la présence d'E. coli.

7.7.3 Si les colonies sont bien isolées sur les géloses L-EMB ou Endo, prélever une colonie typique et l'ensemencer sur une gélose non sélective telle que la gélose NA (les géloses EMB ou MacConkey peuvent aussi être utilisées). Avant d'entreposer les boîtes à 4°C, encercler sur la gélose EMB une autre colonie typique à être placée sur milieu non sélectif si la première colonie n'est pas confirmée comme E. coli . Incuber à 35 °C pendant 18 à 24 h. Utiliser ces cultures pour procéder à l'épreuve de confirmation.

Si les colonies ne sont pas bien isolées sur les boîtes de gélose L-EMB ou Endo, prélever deux colonies typiques et réensemencer sur une gélose EMB afin d'obtenir des colonies isolées. Choisir une colonie typique bien isolée de l'une des géloses EMB et ensemencer sur une gélose non sélective telle que la gélose NA (les géloses EMB ou MacConkey peuvent aussi être utilisées). Réfrigérer la deuxième gélose EMB au cas où il faudrait l'utiliser ultérieurement. Incuber comme indiqué ci-dessus et utiliser ces cultures pour procéder à l'épreuve de confirmation.

7.7.4 GIMViC

À partir des géloses ensemencées (NA, EMB ou MacConkey), inoculer une éprouvette de bouillon EC (milieu G) et les milieux IMViC. L'ensemble des milieux GIMViC comprend le milieu « G » qui est le deuxième bouillon EC, le milieu « I », qui est le bouillon de tryptone, les milieux « M » et « V » qui sont du bouillon glucosé tamponné, et le milieu « C », qui est la gélose au citrate de Simmon. Si les épreuves GIMViC ne sont pas effectuées dans les 96 h suivant l'ensemencement des géloses non sélectives, préparer des pentes ou géloses fraîches avant d'ensemencer les milieux GIMViC.

Pour chacun des isolats à identifier, inoculer une éprouvette de chacun des milieux GIMViC. Ensemencer les témoins positif et négatif d'IMViC dans chacun des milieux IMViC et les témoins positif et négatif de NPP dans le deuxième bouillon EC.

On peut aussi effectuer les épreuves GIMViC au moyen de systèmes d'analyse disponibles dans le commerce.

Production de gaz à 45°C (G)

Incuber les éprouvettes ensemencées de milieu G (bouillon EC) dans un bain-marie à 45,0 C pendant 24 ± 2 h. Vérifier s'il y a production de gaz. S'il n'y a pas de gaz, incuber pendant 24 ± 2 h de plus et examiner de nouveau. Consigner les résultats.

Indole (I)

Incuber les éprouvettes ensemencées de bouillon de tryptone ou de tryptophane à 35 °C pendant 24 ± 2 h. Ajouter à chaque éprouvette du réactif pour l'indole (disponible dans le commerce) en suivant les instructions du fabricant. L'apparition d'une couleur rouge foncé dans la couche d'alcool indique une réaction positive. Une couleur orange indique probablement la présence de skatole et la réaction peut être consignée comme ±. On considère que la couleur jaune indique une réaction négative.

Épreuve au rouge de méthyle (RM) et de Voges-Proskauer (VP) (MVi)

Ensemencer deux éprouvettes de bouillon glucosé tamponné et incuber à 35 °C pendant 48 ± 2 h. Utiliser les réactifs RM et VP (disponibles dans le commerce) en suivant les instructions du fabricant. La réaction de VP est positive si une couleur rose éosine apparaît après 5 à 10 minutes. L'épreuve au RM est positive s'il y a formation d'une couleur rouge et négative si la couleur est jaune.

Épreuve au citrate de Simmon (C)

Pour ensemencer les pentes de gélose SC, utiliser une aiguille droite et appliquer une petit inoculum. Éviter de transférer des nutriments avec l'inoculum, car ces nutriments (carbone) pourraient provoquer la formation d'une couleur bleue et une interprétation erronée. Incuber les pentes de gélose à 35 C pendant 48 ± 2 h et observer pour y déceler toute croissance. Toute croissance visible (réaction positive) est généralement accompagnée d'un changement de couleur, qui vire du vert au bleu foncé.

Interprétation

Le tableau I présente les réactions GIMViC caractéristique d'E. coli. On peut au besoin différencier les coliformes courants en utilisant les données du tableau II.

Si l'on obtient, dans les milieux GIMViC, des réactions caractéristiques d'E. coli, il n'est pas nécessaire d'analyser le deuxième isolat. Cependant, si le premier isolat présente des résultats non caractéristiques dans les milieux GIMViC, il faut soumettre le deuxième isolat aux réactions GIMViC. Répéter les étapes de confirmation. Si les deux isolats ne produisent pas des résultats IMViC typiques d'E. coli, on considère alors qu'il n'y a pas d'E. coli dans l'éprouvette de bouillon EC primaire d'où proviennent les isolats.

7.7.5 Trousses d'identification rapide

On peut également utiliser des trousses d'identification rapide pour identifier E. coli. Suivre les instructions du fabricant.

7.7.6 Calcul du NPP

Calculer le NPP d'E. coli par 100 ml d'eau en suivant les instructions de l'Annexe D du volume 1, en fonction du nombre d'éprouvettes contenant des isolats qui ont produit des réactions GIMViC caractéristiques d'E. coli indiquées ci-dessus ou confirmées comme E. coli au moyen de trousses d'identification rapide.