CHAPITRE 6

PRODUCTION DE MICROORGANISMES À GRANDE ÉCHELLE

6.1 INTRODUCTION

Comme le Canada étend rapidement sa base industrielle dans le domaine de la biotechnologie, il faut absolument examiner la question de la fermentation industrielle et de la manipulation à grande échelle des microorganismes de sorte que toutes les manipulations soient effectuées dans des conditions de confinement qui réduiront au minimum le risque menaçant les travailleurs et l'environnement. Il faut noter que le travail à grande échelle n'est pas nécessairement plus dangereux que le travail à l'échelle du laboratoire. En fait, il est souvent moins inquiétant car la plupart des opérations sont automatisées dans le cas de la fermentation et elles sont souvent effectuées dans des systèmes fermés, ce qui réduit la probabilité que l'opérateur soit exposé. On en a fait la démonstration avec de nombreux agents très infectieux utilisés pour la production des vaccins. Cependant, tous les organismes qui utilisent la fermentation à grande échelle doivent s'assurer de disposer d'un équipement approprié pour ces travaux et de plans d'urgence pour réduire les risques au minimum au cas où le procédé fonctionnerait mal.

Le présent chapitre servira de guide pour les travaux liés aux procédés à grande échelle. Les chapitres précédents renferment de l'information pouvant être pertinente. La culture à grande échelle de microorganismes peut entraîner d'autres dangers que ceux dont traite le présent chapitre. Ces dangers doivent être identifiés et pris en considération.

Pour régler la question des lignes directrices sur la production de microorganismes à grande échelle, un groupe de travail composé des personnes suivantes a préparé le chapitre qui suit:

Lorne Babiuk (Ph. D.)
Dépt. de microbiologie vétérinaire
Saskatoon (Saskatchewan)

Donald Gerson (Ph.D.)
Apotex Fermentation
Winnipeg (Manitoba)

M. Jake Ceschiutti
Laboratoires Connaught
Willowdale (Ontario)

Ella Keshavarz(Ph.D.)
BioRule Inc.
Edmonton (Alberta)

Kenneth Stevenson (Ph.D.)
Dept des Sc. biologiques
Université de Calgary
Calgary (Alberta)

Mr. T. Stineman
Allelix
Biopharmaceuticals Inc.
Mississauga (Ontario)

L'objectif du groupe de travail était de produire un document technique pour ceux qui participent à la conception, à la construction, au fonctionnement ou aux travaux dans des établissements de recherche et dans des établissements industriels où on manipule des microorganismes à grande échelle. Le présent document porte donc sur l'utilisation de microorganismes dans des conditions différentes de celles qui sont décrites dans les chapitres précédents. Le comité considère que des travaux sont à grande échelle lorsqu'ils font appel à des fermenteurs et à de l'équipement qui ne peuvent être facilement déplacés et stérilisés à l'autoclave et qui nécessitent donc une stérilisation in situ. Ceci s'appliquerait normalement aux volumes supérieurs à 10 litres.

Un certain nombre de pays se sont penchés sur le problème de travailler à grande échelle avec des organismes dont l'ADN a été modifié par recombinaison. L'objectif du groupe de travail était de présenter des lignes directrices analogues à celles qui ont été adoptées par d'autres pays, mais il était aussi important d'inclure la fermentation à grande échelle de tous les microorganismes.

Le comité est d'avis qu'un microorganisme quelconque ne présente pas nécessairement un danger accru parce qu'il a subi des manipulations génétiques. Par exemple, il est possible qu'un microorganisme dont le patrimoine génétique a été modifié (mutants par délétion) puisse avoir une capacité réduite à provoquer des infections chez les humains ou chez les animaux en raison de la disparition d'un gène de virulence spécifique. De même, l'insertion de gènes étrangers dans un organime à un endroit donné peut soit réduire soit augmenter sa virulence. Il faut donc considérer chaque manipulation cas par cas. Le comité recommande que dans la mesure du possible, l'organisme soit modifié de telle façon que son caractère pathogène, sa dissémination et sa survie dans l'environnement soient réduits. Une fois que le niveau de risque a été déterminé, chaque organisme doit être manipulé conformément aux critères de cette catégorie de risque.

Le présent chapitre ne porte pas sur des questions relatives à la libération intentionnelle de microorganismes dans l'environnement; cependant, les pratiques de confinement qui sont recommandées devraient être suffisantes pour réduire la libération simultanée de microorganismes pouvant être néfastes pour l'environnement.

6.3 CONSIDÉRATIONS PARTICULIÈRES

6.3.1 Agent de sécurité biologique

Lorsque dans une installation de production, on travaille avec des organismes appartenant aux groupes de risque 2 à 4, on doit nommer un agent de sécurité biologique (ASB) qui a de l'expérience et possède des connaissances en ce qui concerne la manipulation des microorganismes pathogènes et les cellules eucaryotes ainsi que le confinement à grande échelle.

6.3.2 Plantes et animaux transgéniques

La production commerciale de bioproduits à partir de plantes ou d'animaux transgéniques présente un potentiel considérable. La libération potentielle d'organismes transgéniques dans l'environnement et la transmission de nouveaux gènes à d'autres plantes et animaux doit être prise en compte au moment de la conception du système et des installations de production où se trouveront les organismes transgéniques. Dans chaque cas, le niveau de risque doit être déterminé en consultation avec le service gouvernemental approprié.

Dans la présente section, on traitera principalement des plantes et animaux transgéniques qui servent à produire des bioproduitset du confinement requis pour ces activités.

Dans le cas des animaux transgéniques, la première considération veut qu'ils soient manipulés conformément aux lignes directrices présentées par le Conseil canadien de protection des animaux. Il est important de prendre en considération la capacité de l'animal à transmettre les gènes par croisement intraspécifique ou avec des espèces apparentées. Dans ces conditions, il est important que les organismes transgéniques soient bien confinés pour empêcher la propagation des modifications génétiques. On recommande que les organismes transgéniques soient si possible créés à l'aide de méthodes qui limitent la possibilité de transmission des gènes d'un hôte à l'autre.

Les plantes transgéniques pourraient transmettre de nouvelles caractéristiques à d'autres plantes, ce qui modifierait le patrimoine génétique de l'espèce. Comme la transmission se fait par le pollen, les plantes transgéniques devraient être des sujets stériles ou être confinées à une chambre de croissance ou à une serre conçue de manière à empêcher la libération du pollen par l'intermédiaire de l'air ou des insectes. Si on laisse les plantes atteindre la maturité, il faut prendre soin de confiner les graines à une serre ou à une chambre de croissance.

Si des microorganismes vivants sont utilisés comme vecteurs pour la transfection, le niveau de confinement pour les plantes ou les animaux inoculés avec ces microorganismes recombinants viables doit être au moins aussi élevé que celui qui est requis pour le travail avec ce microorganisme spécifique. Les organismes transgéniques (p. ex. ceux qui sont produits par micro-injection, par des vecteurs défectueux pour ce qui est de la réplication ou autres séquences qui ne sont pas transmises horizontalement) peuvent normalement être manipulés au niveau de confinement 1. Les recommandations suivantes devraient être considérées avant que soient entreprises des études transgéniques:

1. Il ne faut pas utiliser des copies complètes d'un génome ou du génome de réplication.

2. Les produits ne devraient pas contenir des gènes capables de causer une transformation néoplasique chez les animaux.

3. La probabilité de recombinaison avec des microorganismes étrangers devrait être minime ou nulle.

6.3.3 Lignées cellulaires

Les dangers biologiques liés à l'utilisation des cellules de mammifère et des autres cellules cultivées se répartissent dans les trois catégories suivantes:

1. Les cultures primaires de cellules de mammifère et d'autres cellules peuvent contenir des agents infectieux ou de l'ADN intégré présents à l'origine chez l'animal ou la personne dont proviennent les cultures. Chaque fois que c'est possible, on devrait chercher à déterminer au moyen de tests si le donneur porte des agents soupçonnés d'être pathogènes avant la préparation de la culture et la culture devrait être considérée comme étant contaminée jusqu'à preuve du contraire. Ces cultures primaires devraient être manipulées de manière appropriée compte tenu de la catégorie de risque à laquelle appartient le contaminant soupçonné et des précautions devraient être prises contre une exposition parentérale ou autre du personnel de laboratoire.

2. Les lignées cellulaires dont on sait qu'elles contiennent des agents infectieux ou de l'ADN intégré devraient être manipulées de la manière correspondant à la catégorie de risque de l'agent.

3. Les lignées cellulaires qui sont considérées exemptes d'agent infectieux peuvent, rarement, présenter un danger biologique. En cas d'administration parentérale accidentelle, la réponse immunitaire normale devrait assurer une protection, empêcher une croissance progressive et provoquer le rejet des cellules ransplantées accidentellement.

6.4 NIVEAUX ET PRATIQUES DE CONFINEMENT

6.4.1 Niveau de confinement grande échelle 1 (GÉ1)

Les microorganismes dont on a montré qu'ils n'étaient pas pathogènes, qu'ils ne contiennent pas d'agents adventices et qui sont depuis longtemps utilisés en toute sécurité dans l'industrie ne sont pas pris en compte dans ce groupe de niveau de confinement.

Au fur et à mesure que le volume cultivé et la quantité de biomasse augmentent, de l'échelle du laboratoire à celle de la mise au point, ou à celle de la production, il faut prendre de plus en plus soin de limiter la dispersion des agents appartenant à la catégorie de risque 1, ce qui concorde avec les pratiques actuelles en microbiologie à grande échelle.

Dans le cas des organismes génétiquement modifiés, certains critères sont nécessaires pour assurer la protection. L'organisme hôte devrait être un agent non pathogène qui n'a pas d'agents adventices, qui a été utilisé auparavant en toute sécurité et dont la capacité de survie dans l'environnement est limitée. Des vecteurs portant des séquences insérées devraient être bien caractérisés et exempts de séquences qui entraînent des effets néfastes chez les humains, les animaux, les plantes ou l'environnement. Le génome inséré devrait avoir une taille limitée à la plus petite séquence requise et il ne devrait pas accroître la stabilité du produit génétique dans l'environnement.

Des marqueurs de résistance devraient être transférés à des organismes avec précaution pour éviter l'acquisition d'une résistance risquant de nuire à l'utilisation thérapeutique des agents antimicrobiens. L'organisme recombinant obtenu devrait être un agent non pathogène, ou sinon, dont la survie est limitée et qui n'aura pas d'effets néfastes sur l'environnement.

Le niveau de confinement GÉ1 convient aux travaux à grande échelle avec des agents de la catégorie de risque 1. En plus des exigences du niveau de confinement 1 des lignes directrices sur la production de microorganismes à grande échelle, les exigences suivantes doivent être respectées :

Exigences physiques

• La zone de travail et l'équipement doivent être convenablement planifiés et appropriés pour l'utilisation souhaitée.

• L'équipement devrait être conçu pour réduire au minimum la production d'aérosols.

• L'équipement de production doit confiner les organismes à l'intérieur d'un système fermé.

• L'équipement de production et les opérations doivent être conçus pour réduire au minimum les effets environnementaux.

Exigences opérationnelles

• Tout le personnel devra avoir reçu une formation adéquate et connaître les mesures de sécurité en milieu de travail ainsi que les protocoles.
• Un plan de nettoyage et, si nécessaire, de désinfection en cas de déversements importants doit être élaboré et être prêt à utiliser au besoin.

6.4.2 Niveau de confinement grande échelle 2 (GÉ2)

La culture ou le traitement à grande échelle des agents appartenant au groupe de risque 2 exigent un confinement supérieur à celui des opérations à l'échelle du laboratoire.

Le niveau de confirnement GÉ2 convient aux travaux à grande échelle avec des agents appartenant à la catégorie de risque 2. En plus des exigences correspondant au niveau de confinement GÉ1 et au niveau de confinement 2 des lignes directrices en matière de biosécurité en laboratoire, les exigences suivantes doivent être respectées:

Exigences physiques

• L'équipement de production doit confiner les organismes à l'intérieur d'un système fermé et être muni d'un filtre HEPA (filtre haute efficacité pour particules aériennes) ou l'équivalent, dont l'intégrité aura été testée de manière à empêcher la libération d'aérosols de l'organisme traité. D'autres mesures équivalentes (c.à-d. l'incinération ou le barbotage avec des désinfectants chimiques) peuvent être employées pour empêcher la libération des microorganismes.

• L'équipement de production doit pouvoir être décontaminé au moyen d'une méthode d'inactivation validée.

• Les opérations et le passage d'une opération à l'autre doivent être conçus de manière à empêcher la libération des aérosols.

• Les joints et les dispositifs mécaniques de l'équipement de production doivent être conçus de manière à empêcher les fuites ou doivent se trouver dans des enceintes à filtre HEPA ou l'équivalent.

Exigences opérationnelles

• La décontamination de l'équipement de production et de l'effluent doit être effectuée au moyen d'une méthode d'inactivation validée.

• La décontamination doit se faire avant que le confinement ne soit interrompu.

• L'échantillonnage doit être effectué de manière contrôlée afin de prévenir la libération de matières infectieuses.

• L'équipement de production doit être régulièrement soumis à des essais visant à vérifier l'intégrité des capacités de confinement (c.-à-d. après chaque utilisation ou opération) et on doit consigner les résultats de ces essais.

• Seul le personnel autorisé peut entrer dans les zones de production.

• Le personnel doit connaître parfaitement les méthodes d'urgence pour faire face aux déversements ou à la libération accidentelle d'organismes viables. Ces méthodes doivent être affichées et la formation doit être documentée.

• L'équipement destiné aux interventions d'urgence et à la décontamination doit être facilement accessible à partir de la zone de production et il doit être entretenu pour pouvoir être utilisé immédiatement et efficacement.

6.4.3 Niveau de confinement grande échelle 3 (GÉ3)

La production et le traitement à grande échelle des agents appartenant à la catégorie de risque 3 peuvent mettre sérieusement en danger les gens, les animaux et l'environnement. Le niveau de confinement GÉ3 est caractérisé par un fonctionnement qui fait intervenir les niveaux primaire et secondaire de confinement physique.

Le niveau de confirnement GÉ3 convient aux travaux à grande échelle avec des agents appartenant à la catégorie de risque 3. En plus des exigences relatives au niveau de confinement GÉ2 et au niveau de confinement 3 des lignes directrices en matière de biosécurité en laboratoire, les exigences suivantes doivent être respectées:

Exigences physiques

• L'air qui quitte la zone de confinement doit être filtré sur filtre HEPA.

• Des dispositions doivent être prises pour confiner tout le volume libéré par tous les fluides de production dans la zone de production.

• Tous les liquides potentiellement contaminés doivent être transférés dans des tuyaux fermés.

• L'effluent doit être acheminé jusqu'à un système de décontamination qui est régulièrement validé pour que son efficacité soit assurée.

• Des douches et des vestiaires doivent être aménagés.

Exigences opérationnelles

• L'entrée dans la zone de production doit être réservée strictement aux personnes requises pour des besoins immédiats pendant la production.

• Une fois entré, tout le personnel devrait enlever ses vêtements d'extérieur pour mettre des vêtements et des chaussures spéciaux de laboratoire. Les vêtements de laboratoire doivent être décontaminés avant le lavage ou l'élimination.

• Le personnel devrait prendre une douche à la sortie.

• On recommande que des mesures soient prises afin d'assurer le transfert électronique de toutes les données à partir de la zone de confinement (p. ex.. ordinateurs en réseau).

6.4.4 Niveau de confinement grande échelle 4 (GÉ4)

Aucune exigence spécifique n'a été énoncée dans le cas de la recherche ou de la production à grande échelle d'organismes viables classifiés dans la catégorie de risque 4. Ces exigences seront établies individuellement, par des consultations avec le Bureau de biosécurité du Laboratoire de lutte contre la maladie, Santé Canada.

6.5 TRANSPORT DE PRODUITS À GRANDE ÉCHELLE

6.5.1 Transport

Des exigences au sujet de l'expédition des agents infectieux sont énoncées dans la section 3.3 des Lignes directrices en matière de biosécurité en laboratoire. Plus particulièrement, tous les microorganismes appartenant aux catégories de risque 2, 3 ou 4 doivent être emballés, étiquetés et transportés conformément à la loi et au règlement sur le transport des marchandises dangereuses.

On peut obtenir des renseignements supplémentaires en s'adressant à la Direction générale du transport des marchandises dangereuses de Transports Canada, 344, rue Slater, 14e étage, Ottawa, Ontario K1A 0N3 (tél.:(613) 958-0517).

6.5.2 Transport sur place entre des zones de confinement

Le transport des microorganismes appartenant à la catégorie de risque 2 ou à une catégorie de risque supérieure à l'intérieur d'une installation doit être effectuée à l'intérieur d'un système fermé. Autrement, de la tuyauterie ou un contenant sûr incassable, hermétique doivent être utilisés. Le contenant ou les tuyaux de transferts doivent pouvoir être décontaminés.

Le plan d'intervention d'urgence des installations doit comporter une disposition visant à répondre à un déversement, à une fuite, ou à un accident pendant le transport entre les zones de confinement. Tout le matériel et l'équipement d'intervention d'urgence doivent être prêts à être utilisés à n'importe quel moment.

[Précédente] [Table des matières] [Prochaine]

[Lignes directrices en matière de biosécurité en laboratoire]