Procédure de laboratoire MFLP-86
janvier 2003
(PDF Version)

Kim Ziebell
Laboratoire des zoonoses alimentaires
Santé Canada,
Guelph, Ontario, N1G 3W4
Courriel: Kim_Ziebell@hc-sc.gc.ca

1. APPLICATION

Cette méthode s'applique à l'identification rapide d'Escherichia coli vérocytotoxigène (ECVT) isolé dans les aliments et autres échantillons par la méthode de la DHVDV (6.1), les méthodes de la DGPSA (6.3) ou une autre méthode de détection d'Escherichia coli O157 ou autres ECVT. Elle peut servir à l'identification finale des colonies positives présomptives isolées sur gélose MacConkey ou sur toute gélose couramment employée pour isoler ce pathogène à partir de cultures d'enrichissement. Si des mesures de conformité en fonction d'un produit sont prévues, et lorsque stipulé, seule les méthodes de la DGPSA peuvent être employées ou pour la confirmation de colonies positives par la réaction en chaîne de la polymérase.

2. PRINCIPE

Après la procédure d'isolement, une portion des colonies positives présomptives cultivées sur gélose MacConkey (Mac) est soumise à la réaction en chaîne de la polymérase (PCR)*, qui amplifie une séquence d'ADN spécifique du gène de la toxine. Les oligonucléotides utilisés pour amorcer la PCR sont hautement spécifiques pour les ECVT et n'amplifient pas l'ADN des organismes autres qu'ECVT. Le fragment d'ADN ainsi amplifié a une masse moléculaire spécifique définie par les amorces et est facile à identifier par électrophorèse sur gel d'agarose. La méthode permet d'identifier en 5 heures les colonies positives présomptives et remplace les tests usuels de dépistage et de confirmation, ce qui constitue une économie considérable de temps, de main d'ouvre et d'argent. La technique PCR s'est révélée une méthode hautement spécifique et hautement sensible pour identifier les ECVT à partir de divers échantillons.

*La firme Hoffman-Laroche détient des brevets américains pour le procédé de la réaction en chaîne de la polymérase.

3. MATÉRIEL ET APPAREILS

1. Cycleur thermique (Modèle 9600, Perkin-Elmer Cetus) ou l'équivalent.
   
   
2. Four à micro-ondes ou plaque chauffante.
   
   
3. Plateau à gel submergé, réservoir de tampon et bloc d'alimentation.
   
   
4. Transilluminateur UV (courte longueur d'onde), pour visionner l'ADN coloré sur les gels d'agarose.
   
   
5. Système de photo documentation (facultatif, pour les dossiers photographiques), y compris un appareil-photo Polaroid (manuel ou fixe).
6. Pipetteurs, dans une gamme de volumes (0.5-1000/ L).
   
   
7. Eau stérile Milli-que (MQ) ou l'équivalent (purifiée ou distillée).